论文部分内容阅读
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染是我国最重大的传染病之一，我国约有1.2亿HBV携带者，其中2000多万人为慢性乙肝患者。HBV感染及其相关疾病严重影响着患者的健康，同时也使患者家庭及社会承受着巨大的经济负担。现在对HBV感染致病机理仍不是很清楚，对HBV感染的治疗也未找到特别有效的药物。目前临床上广泛使用的抗HBV感染药物包括干扰素(interferon,IFN)和核苷（酸）类似物，但使用干扰素副作用较大，而核苷（酸）类似物存在停药后容易复发，长期使用易发生耐药变异。因此需要开辟新的思路以研发出新型高效的HBV感染相关疾病的治疗药物。microRNA（miRNA）是一类非编码单链小RNA分子，广泛存在于动物、植物及病毒中，广泛参与诸如细胞生长、分化、凋亡、肿瘤发生以及病毒发病机制等多种过程的调节。最近的研究表明在病毒感染宿主的过程中，miRNA可能扮演了重要的作用。本研究旨在进行HBV感染相关miRNA分子的筛选并进行分子机制研究，希望上述研究结果能为从miRNA角度阐明HBV的感染机制提供理论依据，同时也为HBV感染相关疾病的诊断和治疗提供潜在的诊断标志物和药物靶标。本研究利用已建立的miRNA表达载体库在细胞瞬时转染模型中进行HBV复制相关miRNA分子的筛选并选择其中具有代表性的miRNA分子进行抗HBV复制的分子机制研究。本论文的研究内容主要包括以下两个方面：1）利用miRNA表达载体库转染HepG2细胞，进行HBV复制相关miRNA分子的筛选；2）miR-141抑制HBV复制的分子机制研究。本研究所获得的研究结果如下：1、采用miRNA表达载体与HBV表达载体瞬时转染HepG2细胞作为筛选模型对miRNA表达载体库进行了筛选，共获得了6条与HBV复制相关的miRNA分子。对瞬时转染后细胞培养液上清的HBsAg检测表明miR-98，miR-137分子与HBV表达载体共转染后细胞上清HBsAg水平升高； miR-101， miR-125a，miR-125b，miR-141分子与HBV表达载体共转染后细胞上清HBsAg水平下降。2、通过生物信息学方法对上述6个miRNA的宿主靶基因进行了预测，结果包含数个参与细胞转录调控及重要信号通路的基因，其中已有研究表明FOXA1，PPARA，RXRA等是HBV复制所必需的细胞调控因子。采用luciferase报告基因对上述miRNA与这些靶基因的相互作用进行了验证。结果表明miR-101与HNF1B3’-UTR，miR-137与NF1及SP13’-UTR，miR-141与PPARA3’-UTR产生相互作用，抑制luciferase活性。3、 miR-141抑制HBV复制的机制研究。基于细胞瞬时转染筛选结果及luciferase报告基因靶位点的验证结果，我们选择miR-141分子作为抑制HBV复制的研究对象。通过细胞瞬时转染验证了合成miR-141分子（miR-141mimics）对HBV抗原（HBs/HBe）及病毒DNA都具有抑制作用，miR-141抑制剂（miR-141inhibitor）则对HBV抗原（HBs/HBe）表达具有促进作用，证明了筛选结果的正确；采用miRNA分子靶基因预测软件（TargetScan）对PPARA基因序列中miR-141可能的靶位点进行了预测，结果显示PPARA3’-UTR含有4个miR-141可能的靶标。采用luciferase报告基因对预测靶标位点的正确性进行了验证，结果显示miR-141可以与PPARA3’-UTR中3个靶位点产生作用；通过PPARA特异性siRNA验证了抑制PPARA表达后对HBV抗原（HBs/HBe）及病毒DNA复制具有抑制，证明了miR-141作用于HBV复制的可能性；采用luciferase报告基因进行的启动子功能分析表明，miR-141对PPARA的抑制作用可以降低HBV基因组启动子活性，阐明了miR-141抑制HBV复制的分子途径。综上所述，本研究采用瞬时转染细胞模型对miRNA表达载体库进行了筛选并验证了miR-141对HBV复制具有抑制作用，发现HBV复制细胞因子PPARA是miR-141在此过程中的靶标。