论文部分内容阅读
目的： 基于中药复方旋覆归连方体外抑制人食管癌 ECa9706 细胞株生长的情况,探讨旋覆归连方的作用机制。 方法： 对旋覆归连方用不同浓度乙醇冷浸法醇提提取；用MTT法检测旋覆归连方对食管癌细胞株的生长抑制作用,依据抑制率筛选最佳乙醇浓度：运用高效液相法分析旋覆归连方的药物成分；Pearson Correlation法做抑制率和成分峰面积的相关分析；运用偏最小二乘法(PLS)对抑制率和成分峰面积做多元回归分析；应用昂立公司Affymetrix Human Genome U219 array Strip 芯片检测基因表达,差异基因筛选应用倍数检验；应用DAVID 2008 Functional Annotation Bioinforma和KEGG Tools(KEGG PATHWAY Database)在线分析上下调基因本体功能和信号通路；采用流式细胞仪技术检测旋覆归连方对食管癌细胞株 ECa9706 细胞周期和凋亡的影响。 结果： 1. 旋覆归连方醇提最佳乙醇浓度为85%,以抑制率为观察指标对七种提取物进行的层级聚类结果显示：无水乙醇、95%乙醇最为接近和85%乙醇提取物归为一类,应用概率法95%置信区间85%乙醇提取物IC50值为58.11μg/mL。 2. MTT法显示旋覆归连方不同浓度作用于人食管癌ECa9706细胞48h后,与阴性对照组相比,均能使细胞株OD值降低,抑制率随浓度增高而增高；选用浓度为15μg/mL、25μg/mL和60μg/mL作用于人食管癌ECa9706细胞24h、48h、72h和96h后, OD值均比阴性对照组有不同程度的降低,抑制率呈剂量、时间依赖性。 3.高效液相法分析旋覆归连方不同浓度乙醇提取物的药物成分得到 22 个稳定峰,峰面积和抑制率做 Pearson Correlation相关分析发现 10个峰与药物抑制率呈显著相关(p<0.05),根据对照品确定了小檗碱和阿魏酸两个成分。偏小二乘法分析10个峰峰面积与抑制率的关系,并建立了良好的多元回归模型。 4.对药物组和对照组的基因进行倍数检验,满足条件的差异基因有1294个,其中下调基因有 938 个,上调基因有 356 个。下调基因的本体功能分析中,主要与细胞周期、细胞增殖、泛素和RNA剪接等有关；上调基因本体功能分析中,主要与细胞凋亡、细胞应答、转录及 DNA损伤等有关。下调基因信号通路中主要与细胞周期、肿瘤信号通路和胰岛素信号通路等有关；上调基因信号通路中,主要与剪接体和North信号通路等有关。 5.流式细胞仪检测细胞周期结果显示：旋覆归连方作用于 ECa9706 细胞 48h 后与阴性对照组比较均能使 G0/G1期细胞显著增多(p<0.05),使S、G2/M期细胞较阴性对照组显著减少(p<0.05),G0/G1期细胞数量随作用浓度升高而增加；检测细胞凋亡结果显示：旋覆归连方作用于 ECa9706 细胞 48h、能明显诱导食管癌细胞凋亡(p<0.05),以 60μg/mL 浓度组的作用效果最佳,其次为25μg/mL浓度组和15μg/mL浓度组。 结论： 1.旋覆归连方 85%乙醇冷浸法提取工艺简便易行,所得提取物对食管癌细胞的抑制作用比较稳定。 2. 旋覆归连方能抑制人食管癌 ECa9706 细胞的体外增殖,其抑制作用呈剂量-时间-效应关系,并能显著影响人食管癌ECa9706细胞的形态。 3. 高效液相法分析旋覆归连方成分,PLS 建立了峰面积和抑制率的多元回归模型,初步探讨了该方成分与抑制率之间的关系,为进一步研究该方提供依据。 4.应用基因表达谱芯片检测并筛选差异基因,发现该方能够下调 Cdc25A、CDK4和E2F1等细胞周期相关基因、上调RPS27L等细胞凋亡基因在食管癌ECa9706细胞中的表达,通过多靶点多通路抑制食管癌细胞的生长,诱导食管癌细胞的凋亡。 5.旋覆归连方对ECa9706细胞周期各时相均有影响,主要将ECa9706细胞周期阻滞在G0/G1期,且有显著的浓度依赖性。旋覆归连方能体外诱导人食管癌细胞ECa9706的凋亡,凋亡率与浓度呈正相关。