新一代DNA测序技术已成为近年来的国际上基因组学研究的热点，受到了越来越多的关注。同传统DNA测序方法相比，新一代DNA测序技术具有通量高、成本低、快速等特点，已被应用于众多的研究领域。但是，目前的测序方法仍然存在较多缺点，如测序长度短、成本相对较高等。本研究发展了两种新的高通量DNA测序方法：反向杂交偶联延伸测序方法和内切酶V介导的连接测序方法，以提高测序长度和降低成本。进一步地，利用连接微测序的方法成功地对大量样本的SNP位点进行芯片检测。　　 1．反向杂交偶联延伸测序方法。　　 发展了一种新的杂交测序方法。传统的杂交测序方法是把一系列长度为K个碱基共4k条序列固定在芯片上，然后把标记的待测DNA模板去杂交，通过检测杂交信号来确定该序列的杂交序列谱。如果要测定长DNA序列，那么所需杂交探针数将成指数增加，并且由于末端碱基的错配，会导致探针识别能力降低，假阳性率增高。　　 反向杂交偶联延伸测序方法是对3’末端为已知碱基的杂交引物平行地与待测DNA序列经过多次杂交、延伸、检测来实现。先把待测样本固定在芯片上，然后把每条探针依次与芯片进行杂交。在此基础上，加入DNA聚合酶及荧光标记的dNTP进行序列延伸，通过对有无荧光信号就可以判别哪些待测点含有该探针序列。其检测流程如下：(1)3’末端带有三个或三个以上已知碱基的杂交引物与固定的未知DNA模板在杂交液中加热，然后冷却退火进行杂交；(2)用洗液洗净杂交液后，标记单体在聚合酶的催化下，在杂交引物的3’末端延伸一个或多个碱基；通过芯片扫描仪读取延伸碱基的信息，确定未知DNA模板上的包含数个碱基的序列；(3)用变性液将延伸碱基的杂交引物从未知DNA模板中洗脱，再将3’末端已知碱基序列不同的杂交引物按步骤(1)与未知DNA模板杂交并再次进行步骤(2)，确定未知DNA模板上包含数个碱基的不同序列；用不同的杂交引物重复上述过程，直到完成DNA序列测定。　　 利用该方法对一条固定在芯片中DNA序列进行了测定，结果与原始序列一致，因此它可以应用于固定有大量模板DNA芯片上，该方法具有通量高、测序能力强、成本低和准确性高等特点。　　 2．内切酶V介导的连接测序方法。　　 基于连接反应的测序（如SOLiD系统）是先把通用引物与待测DNA两端的接头序列互补结合；然后在连接酶的介导下，将一个带有荧光标记8bp长的核酸探针(fluorescently labeled octamers)连接到引物3’末端；反应完成之后，通过荧光图像的分析即可鉴定出荧光标签所对应的测定碱基；然后通过切断第五碱基和第六碱基之间的连接，去掉荧光标签。如此反复，就可以获得每间隔四个碱基的第五位碱基的确切信息。提出了使用不同长度的引物(+1或者-1)或者在不同位点（比如第2位碱基）标记荧光的8bp核酸探针片段来实现连接测序，以获得整条模板片段的完整序列信息。　　 所提出的探针荧光切割方法不同在于：反应中采用的切割反应是在内切酶V（也称为脱氧次黄核苷3’内切酶）的作用下进行的。核酸内切酶V是在E.coli中发现的一种DNA修复酶。它识别DNA中的脱氧次黄核苷，即脱氧腺苷的去氨基产物。核酸内切酶V可以在距错配脱氧次黄苷第二个或第三个磷酸二酯键的3’末端进行切割，切割第二个磷酸二酯键的效率是95％，第三个磷酸二酯键的效率是5%，能够产生一个3’羟基、5’磷酸的切口。利用该切口，进行后续的杂交连接反应，从而实现多个碱基的测定。通过引入硫代修饰的方法，来抑制次要切割位点，以达到唯一切割位点的目的。该方案已得到实殓结果的验证，实现了25bp序列的正确读取。　　 3．连接微测序方法在SNP分型上的应用。　　 之前本实验室曾经提出一种通过双色荧光杂交的方法在DNA芯片上检测SNP，具有准确性高且操作简便等特点。但该方法的不足之处为每检测一个位点就需要一对荧光标记的探针。分析样本数目不是很多时（如数百个），每个位点荧光探针的费用平摊到每个样本的成本就会大大高于其它分析方法，且位点越多分型费用就越高。为此，提出了将DNA芯片与通用探针连接微测序相结合的SNP检测方法。对于由DNA合成模板构建的DNA芯片的研究表明，采用通用探针连接微测序方法能成功实现SNP分型，为大量临床实际样本的SNP分型奠定了基础。