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铜(Cu)既是植物生长发育所需的微量营养元素,又是污染环境的重金属元素。Cu在植物体内,可以作为酶的辅助因子,促进相关酶活性,因而,它对植物正常的生理代谢、生长发育等起着重要作用。由于含铜农药的不断使用,造成田、地以及果园土壤中铜浓度的增加,为了适应土壤中不断变化的铜离子含量,植物须严格控制铜离子在整体水平和细胞水平上的转运。本实验以桑树作为研究对象,结合生理生化相关指标的测定、差异基因表达水平鉴定、micro RNA对靶基因调控表达,鉴定铜处理下相关转运基因和一些重要的mi RNA及其靶基因的表达分析,为进一步阐述植物高效吸收利用铜的分子机理以及培育铜高效利用新品种具有一定的理论和实际意义。主要研究内容如下:1、桑树铜胁迫的生理生化指标检测、测序数据分析及差异基因的表达鉴定桑树在铜胁迫处理下,测定其生理生化指标MDA、SOD、POD、BCA、PRO的表达水平,结果显示,均有不同程度的变化趋势。选择未处理和铜处理的桑树样本进行转录组和小RNA测序分析,所用的测序技术由北京诺禾致源科技股份有限公司提供。构建两个转录组文库,通过对原始序列过滤,获得56,701,537和53,546,796 Clean reads,Q20、Q30碱基百分比在91%以上。基于比对结果,进行可变剪切分析、新基因的预测以及基因结构优化分析、基因表达量分析,筛选出桑树在正常生长和铜胁迫条件下的差异基因5486个,其中3078个基因表达上调,2408个基因表达下调。选择15个差异基因进行表达验证分析,结果显示,21402441、21395828、21405820等基因相对表达水平差异显著,与测序结果基本一致。构建的两个小RNA文库,通过原始序列过滤,得到Clean reads数及其占raw reads数的比例为14,483,482(94.11%)和11,598,984(97.25%)。基于对比结果,进行保守mi RNA分析、Novel mi RNA预测、mi RNA表达及差异分析和mi RNA靶基因的预测,共鉴定出65个已知mi RNA和78个预测的新mi RNA成熟体,其中共有40个mi RNA在铜胁迫下差异表达,包括27个mi RNA上调表达基因,13个mi RNA下调表达基因。分析了桑树在未处理和铜处理条件下14个差异基因表达验证,其中11个mi RNAs(Novel-2、Novel-18、Novel-23、Novel-24、mi R156a、mi R166n、mi R168a-3p、mi R171e、mi R396a、mi R398b、mi R399f)通过高通量测序和q RT-PCR鉴定为显著差异表达。2、桑树铜转运蛋白ZIP4基因的克隆、表达分析及功能验证从桑树中克隆得到Ma ZIP4基因,其序列长度为1405 bp,包含完整的开放阅读框1152 bp,编码383个氨基酸残基,预测其蛋白质分子质量为95.32 k D,等电点为5.02,属于ZIP(ZIP,IRT-Like proteins)转运蛋白家族。用生物信息学分析其与不同植物物种的同源性及进化树分析。通过q RT-PCR结果显示,与未处理相比,Ma ZIP4基因在不同铜浓度胁迫条件下,其表达调控水平会有不同程度的变动趋势。构建VIGS体系,并运用VIGS技术成功将桑树Ma ZIP4基因沉默。在桑树中沉默Ma ZIP4基因后,叶片中丙二醛(MDA)含量、脯氨酸(PRO)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性以及可溶性蛋白(BCA)含量随着铜离子胁迫浓度的不同,均出现不同的变化波动。表明桑树Ma ZIP4基因沉默,能引起桑树体内与铜胁迫相关酶活性变化,从而影响桑树铜离子调控作用,更进一步说明Ma ZIP4基因在桑树的铜胁迫调控中发挥着重要作用。3、桑树铜转运蛋白HMA2基因的克隆、表达分析及功能验证从桑树中克隆得到MaHMA2基因,其序列长度为1342 bp,包含完整的开放阅读框1194 bp,编码397个氨基酸残基,预测其蛋白质分子质量为42.852 k D,等电点为7.53,属于PIB型ATP(PIB-type ATPase)酶转运蛋白家族。用生物信息学分析其与不同植物物种的同源性及进化树分析。通过q RT-PCR结果显示,与未处理相比,MaHMA2基因在不同铜浓度胁迫条件下,其表达调控水平会有不同程度的变动趋势。构建VIGS体系,并运用VIGS技术成功将桑树MaHMA2基因沉默。在桑树中沉默MaHMA2基因后,叶片中MDA含量、PRO含量、SOD活性、POD活性以及可溶性蛋白含量随着铜离子胁迫浓度的不同,均出现相应的变化趋势。表明桑树MaHMA2基因沉默后,能引起桑树体内与铜胁迫相关酶活性变化,从而影响桑树铜离子调控作用,更进一步说明MaHMA2基因在桑树的铜胁迫响应中发挥着积极作用。4、桑树mi R396a基因瞬时转化过表达鉴定其铜胁迫应答功能获得桑树mi R396a的前体序列,对其二级结构预测发现mi R396a成熟体在前体的3’臂上。构建mi R396a瞬时转化体系,在桑树中瞬时转化过表达mi R396a后,mi R396a与其靶基因的表达水平均和对照组有显著差异,并且不同的铜胁迫浓度也会使其发生不同的变化趋势。结果显示mi R396a在桑树的铜胁迫调控中发挥着重要作用。