卵母细胞体外成熟(in vitro maturation，IVM)培养技术在自然周期或使用少量促性腺激素的周期，将不成熟的卵母细胞在体外培养成熟，进行体外受精和胚胎移植，它克服了促排卵药物的副作用，是今后助孕技术发展的趋势之一。卵母细胞能在体外成熟和受精，并且胚胎移植后可成功妊娠，但体外成熟率和受精率低，胚胎发育阻滞率高，囊胚形成率及妊娠率低。这提示体外成熟的卵母细胞存在着细胞质成熟欠缺或核浆成熟不协调的问题，这是目前制约IVM技术广泛应用的主要障碍，因此继续深入认识卵母细胞的成熟规律和改善体外成熟培养环境是当前的主要研究方向。 卵母细胞内在的质量是其发育到优质胚胎的决定性因素，对卵母细胞中线粒体增殖、功能和动态分布的探讨有助于对体外成熟卵母细胞成熟、受精和胚胎发育异常的了解。线粒体通过氧化磷酸化合成ATP，是有核细胞能量的主要来源。足量的ATP是卵母细胞完成第一次减少分裂的关键因素。线粒体还是卵母细胞内钙离子活动的调节和储存器，在卵母细胞发育和成熟过程中，线粒体动态分布于微管等周围提供ATP和钙离子，促进胞内细胞器和骨架重组完成。卵胞浆内的线粒体对卵母细胞成熟、受精及以后胚胎的发育起着重要的作用。一旦卵母细胞启动成熟进程，线粒体开始聚集在纺锤体和皮质层，提供ATP和钙离子促进细胞骨架和胞浆的运动。影响线粒体功能和线粒体在卵母细胞纺锤体周围聚集的化学物质都可引起减数分裂停滞、延迟，以及染色体的提前分裂或不分离。纺锤体是卵母细胞的一个重要组成部分，在细胞分裂过程中，纺锤体对卵母细胞染色体的平衡、运动、分配和极体的排出有非常重要的作用。纺锤体异常，会导致异常的减数分裂，有可能产生异常的胚胎。它的形态学变化可能反映了体外培养环境中卵母细胞的质量。Polscope利用细胞内大分子结构的双折射性，将光学硬件和数字传导结合起来使纺锤体成像。目前Polscope已用来研究鼠和人的卵母细胞，其获取的纺锤体结构信息与传统固定和荧光免疫方法有高度一致性，对于卵母细胞观察具有非侵袭性，认为可以评价卵母细胞的质量及其以后胚胎的发育潜能。 第1章线粒体对卵母细胞体外成熟及其发育潜能的影响。 目的：线粒体数量少、功能和动态分布的异常改变可能是体外成熟卵母细胞体外成熟率、受精率及妊娠率低的主要原因之一。这一部分研究将培养SD大鼠窦状卵泡来源的卵母细胞，观察体外成熟和卵泡大小对卵母细胞发育潜能的影响，卵母细胞线粒体的增殖、功能和动态分布是否存在异常改变，探讨卵母细胞线粒体的增殖、功能和动态分布对卵母细胞体外成熟和发育潜能的影响。 材料和方法：实验采用25天大小的未成熟SD大鼠，收集直径300-400μm和600-800 μm大小卵泡的卵母细胞卵丘颗粒细胞复合体(oocyte cumulus cellscomplex，COCs)进行体外成熟。采用实时定量PCR检测线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)拷贝数，激光共聚焦显微镜观察线粒体在卵母细胞中的分布，luminator检测ATP含量，并比较体内成熟卵母细胞和各组体外成熟卵母细胞的成熟、受精和其胚胎继续发育能力。 结果：未成熟卵母细胞的mtDNA拷贝数和其窦状卵泡的直径呈显著的线性相关(P<0.01)，R=0.68；未成熟卵母细胞的ATP含量和其窦状卵泡的直径也呈显著的线性相关(P<0.05)，R=0.21。体内成熟卵母细胞的mtDNA拷贝数(103531±25305)和从直径600-800 μm大小窦状卵泡分离出COCs体外培养成熟卵母细胞的mtDNA拷贝数(85061μ37937)显著高于从直径300-400μm大小窦状卵泡分离出COCs体外培养成熟卵母细胞的mtDNA拷贝数(68221±22311，P<0.01)。较成熟卵母细胞，未成熟卵母细胞的的mtDNA拷贝数最少(48689±22464，P<0.01)。体内成熟卵母细胞和从直径600-800μm大小窦状卵泡分离出COCs体外培养成熟卵母细胞的受精率、卵裂率和囊胚形成率显著高于从直径300-400μm大小窦状卵泡分离出COCs体外培养成熟卵母细胞的受精率、卵裂率和4细胞胚胎形成率(P<0.05)。体内成熟卵母细胞的ATP含量(1.02±0.15 pmol)和从直径600-800μm大小窦状卵泡分离出COCs体外培养成熟卵母细胞的ATP含量(0.95±0.16 pmol)显著高于从直径300-400μm大小窦状卵泡分离出COCs体外培养成熟卵母细胞的ATP含量(0.85±0.23 pmol，P<0.05)。较成熟卵母细胞，未成熟卵母细胞的的ATP含量最少(0.62±0.14 pmol，P<0.01)。采用FCCP降低卵母细胞中ATP的含量，卵母细胞的成熟率显著降低(P<0.05)。 体内成熟卵母细胞、从直径600-800μm大小窦状卵泡和从直径300-400μm大小窦状卵泡分离出COCs体外培养成熟卵母细胞红色荧光强度/绿色荧光强度的比率分别为0.169、0.169和O.164(p>0.05)。较成熟卵母细胞，未成熟卵母细胞红色荧光强度/绿色荧光强度的比率最低(0.146，P<0.05)。较直径300-400μm大小窦状卵泡分离出COCs体外培养成熟的卵母细胞，体内成熟卵母细胞和直径600-800μm大小窦状卵泡分离出COCs体外培养成熟卵母细胞的线粒体常分布于卵周皮质区。 第2章体外成熟人卵母细胞中线粒体DNA和ATP含量对纺锤体PoISCOpe观察的影响。 目的：研究将探讨体外成熟人卵母细胞中mtDNA和ATP含量对纺锤体PolScope观察的影响，纺锤体与人卵母细胞质量的关系。 材料和方法：收集和培养ICSI治疗周期GV期卵母细胞，采用纺锤体成像系统PolScope观察纺锤体，实时定量PCR检测mtDNA拷贝数，激光共聚焦显微镜观察线粒体在卵母细胞中的分布，luminator检测ATP含量，比较PolScope观察有无纺锤体的成熟卵母细胞mtDNA和ATP含量、成熟、受精和其胚胎发育能力。 结果：收集了155个ICSI治疗周期GV期卵母细胞，培养48小时后117个卵母细胞排除第一极体，成熟率为75.5﹪，其中51.3﹪(60/117)体外成熟卵在纺锤体成像系统PolScope下可观察到纺锤体。在IVF治疗周期中，受精失败的体内成熟卵母细胞的：mtDNA拷贝数(715708±254492)显著高于ICSI治疗中GV期体外成熟的卵母细胞的mtDNA拷贝数(526309±209099，P<0.05)。在ICSI治疗中GV期卵母细胞体外成熟中，成熟卵母细胞的mtDNA拷贝数和ATP含量(1.82±0.39 pmol)分别显著高于未成熟卵母细胞的mtDNA拷贝数(398441±159610)和ATP含量(1.33±0.34 pmol)。 可检测到纺锤体的成熟卵母细胞的mtDNA拷贝数和ATP含量分别显著高于未检测到纺锤体的成熟卵母细胞的mtDNA拷贝数和ATP含量(P<0.05)。可检测到纺锤体的成熟卵母细胞的正常受精率和胚胎发育能力显著高于未检测到纺锤体的成熟卵母细胞的正常受精率和胚胎发育能力(P<0.05)。GV期卵母细胞体外成熟后行ICSI受精，受精失败卵母细胞的mtDNA拷贝数(4264044-205454)显著低于受精后第三天低发育潜能胚胎的mtDNA拷贝数(5923934-190819)和优质胚胎的mtDNA拷贝数(693350±180457)。 在体外培养液中加入FCCP后，GV期卵母细胞的体外成熟率显著降低(P<0.001)。在FCCP处理组中，体外成熟的卵母细胞的纺锤体检测率为23.1﹪，显著低于无FCCP处理组体外成熟卵母细胞纺锤体的检测率为51.3﹪(P<0.05)。此外，在FCCP处理组中，体外成熟的卵母细胞的ATP含量也显著低于无FCCP处理组体外成熟卵母细胞的ATP含量(P<0.05)。在FCCP处理组中，可检测到纺锤体的6个成熟卵母细胞的ATP含量(1.79±0.28 pmol)明显高于未检测到纺锤体的20成熟卵母细胞的ATP含量(1.56±0.32 pmol)，因试验标本量较小，未达到统计学差异(P=0.15)。而未成熟卵母细胞的ATP含量显著低于成熟卵母细胞的ATP含量(1.00±0.36 pmol，P<0.01)。 结论： (1)尽管小窦状卵泡的卵母细胞可体外成熟，但受精和种植前胚胎发育潜能降低。 (2)低线粒体含量导致ATP生成缺乏是体外成熟卵母细胞发育潜能降低的一个主要因素。 (3)人体外成熟卵母细胞中低线粒体和ATP可导致PolScope观察不到双折射的纺锤体。 (4)对卵母细胞减数分裂期的纺锤体非侵袭性观察可有效用于评价卵母细胞的质量及其以后胚胎的发育潜能。