论文部分内容阅读
病毒使用不同的策略逃避包括诱导免疫抑制在内的免疫监视，最大限度的提高其生存、复制和传播机会，对宿主产生严重临床后果，并引起继发性感染。因此，了解诱导免疫抑制机制对控制人和动物病毒感染至关重要。
小反刍兽疫（Peste des petits ruminants，PPR）是由小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的主要感染绵羊、山羊等小反刍动物的重要传染病，因其极高的发病率和死亡率，严重威胁养羊业，被世界动物卫生组织（Office international des epizooties，OIE）列为必须报告的疾病。本研究的目的是探究PPRV非结构蛋白V在天然免疫中的作用机制。利用实时荧光定量PCR技术（Real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR），检测了V基因在转录水平对维甲酸诱导基因I样受体（Retinoic-acid-inducible gene I like receptor，RLRs）信号通路中RIG-I介导的干扰素（Interferon，IFN）及其下游因子的作用；双荧光素酶报告系统检测了V蛋白在RLRs通路中的作用靶点；qPCR和蛋白免疫印迹（Western blot，WB）进一步研究了V蛋白对内源、外源性IFN介导的抗病毒作用；WB研究了V蛋白对干扰素调节因子3（Interferon regulatory factor3，IRF3）和信号传导及转录激活因子1（Signal transducers and activators of transcription1，STAT1）磷酸化的影响。最后，构建了PPRV全长cDNA克隆及V基因突变全长cDNA克隆。获得以下研究结果：
1.PPRV V蛋白抑制RLRs信号通路介导的INF-β的生成及其下游因子基因转录水平的表达。共转染pRK-Flag-RIG-IN和pcDNA3.1-HA-V至HEK293T细胞，qPCR检测表明PPRV V蛋白极显著抑制RLRs信号通路介导的INF-β的生成及其下游因子干扰素诱导基因56（Interferon stimulated gene，ISG56）、ISG15、CXC趋化因子配体10基因（C-X-C motif chemokine10gene，CXCL10）在基因转录水平的表达（p<0.001）。
2.双荧光素酶报告基因系统检测表明PPRV V蛋白在细胞内的过表达极显著抑制RLRs通路中干扰素刺激反应原件（Interferon-stimulated response elements，ISRE）报告基因活性（p<0.001），表明V蛋白在RLRs通路中可抑制IFN的产生。
3.PPRV V蛋白可显著减少内源、外源性IFN产生抑制HEV、PPRV和EMCV的抗病毒作用。共转染pcDNA3.1-HA-V和pRK-Flag-RIG-IN至HEK293T细胞和Huh7-p6细胞24h后收集上清分别加入到新培养的细胞中继续培养24h后,在HEK293T细胞中接种PPRV和脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV）于12h、24h、36h收取细胞，在Huh7-p6细胞中接种戊型肝炎病毒（Heptitis E virus，HEV）于18h和36h收取细胞，qPCR检测表明PPRV V蛋白在18h可以极显著增加HEV的复制（p<0.001），36h时不影响病毒复制（p>0.05），V蛋白在三个时间段都显著促进PPRV和EMCV复制（p<0.01），表明PPRV V蛋白可显著抑制内源性IFN产生的抗病毒作用。共转染pcDNA3.1-HA-V和pRK-Flag-RIG-IN至HEK293T细胞和Huh7-p6细胞24h后加入商品化IFN-β（1000U/mL）和IFN-α-2b（1000U/mL）处理细胞，在24h后分别感染三种病毒，qPCR和WB检测表明V蛋白明显增加细胞中三种病毒mRNA的表达（p<0.05），说明PPRV V蛋白可显著抑制外源性IFN产生的抗病毒作用。
4.PPRV V通过阻断JAK-STAT途径抑制IFN的抗病毒作用。WB检测表明HEK293T细胞中转染pRK-Flag-RIG-IN增强IRF3磷酸化，转染pcDNA3.1-HA-V降低p369-IRF3和p701-STAT1磷酸化，表明PPRV V蛋白通过抑制JAK-STAT通路中IRF3和STAT1磷酸化减少IFN的产生。
5.构建了PPRV16153bp全长cDNA克隆及V基因突变全长cDNA克隆。根据PPRV基因组序列的保守性，在基因组3端引入锤头状核酶序列（the Hammerhead ribozyme sequence，HamRz），在5端引入T7终止子和丁型肝炎核酶序列（the Hepatitis delta virus ribozyme sequence，HdvRz），运用RT-PCR扩增出病毒7个片段，互相连接获得了全长cDNA克隆（pBluescript SK-PPRV）和V基因突变全长cDNA克隆（pBluescript SK-PPRV△V）。
本文研究了PPRV非结构蛋白V在宿主细胞内介导的天然免疫抑制机制，明确了V蛋白抑制RLRs通路中RIG-I介导的IFNs产生的基本分子机制，从而得出结论V蛋白在JAK-STAT途径中可抑制STAT1和IRF3磷酸化产生IFN的抗病毒作用，构建了PPRV全长cDNA克隆及V基因突变全长cDNA克隆，这些结果对进一步阐明PPRV非结构蛋白介导的天然免疫作用机制奠定了基础。
小反刍兽疫（Peste des petits ruminants，PPR）是由小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的主要感染绵羊、山羊等小反刍动物的重要传染病，因其极高的发病率和死亡率，严重威胁养羊业，被世界动物卫生组织（Office international des epizooties，OIE）列为必须报告的疾病。本研究的目的是探究PPRV非结构蛋白V在天然免疫中的作用机制。利用实时荧光定量PCR技术（Real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR），检测了V基因在转录水平对维甲酸诱导基因I样受体（Retinoic-acid-inducible gene I like receptor，RLRs）信号通路中RIG-I介导的干扰素（Interferon，IFN）及其下游因子的作用；双荧光素酶报告系统检测了V蛋白在RLRs通路中的作用靶点；qPCR和蛋白免疫印迹（Western blot，WB）进一步研究了V蛋白对内源、外源性IFN介导的抗病毒作用；WB研究了V蛋白对干扰素调节因子3（Interferon regulatory factor3，IRF3）和信号传导及转录激活因子1（Signal transducers and activators of transcription1，STAT1）磷酸化的影响。最后，构建了PPRV全长cDNA克隆及V基因突变全长cDNA克隆。获得以下研究结果：
1.PPRV V蛋白抑制RLRs信号通路介导的INF-β的生成及其下游因子基因转录水平的表达。共转染pRK-Flag-RIG-IN和pcDNA3.1-HA-V至HEK293T细胞，qPCR检测表明PPRV V蛋白极显著抑制RLRs信号通路介导的INF-β的生成及其下游因子干扰素诱导基因56（Interferon stimulated gene，ISG56）、ISG15、CXC趋化因子配体10基因（C-X-C motif chemokine10gene，CXCL10）在基因转录水平的表达（p<0.001）。
2.双荧光素酶报告基因系统检测表明PPRV V蛋白在细胞内的过表达极显著抑制RLRs通路中干扰素刺激反应原件（Interferon-stimulated response elements，ISRE）报告基因活性（p<0.001），表明V蛋白在RLRs通路中可抑制IFN的产生。
3.PPRV V蛋白可显著减少内源、外源性IFN产生抑制HEV、PPRV和EMCV的抗病毒作用。共转染pcDNA3.1-HA-V和pRK-Flag-RIG-IN至HEK293T细胞和Huh7-p6细胞24h后收集上清分别加入到新培养的细胞中继续培养24h后,在HEK293T细胞中接种PPRV和脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV）于12h、24h、36h收取细胞，在Huh7-p6细胞中接种戊型肝炎病毒（Heptitis E virus，HEV）于18h和36h收取细胞，qPCR检测表明PPRV V蛋白在18h可以极显著增加HEV的复制（p<0.001），36h时不影响病毒复制（p>0.05），V蛋白在三个时间段都显著促进PPRV和EMCV复制（p<0.01），表明PPRV V蛋白可显著抑制内源性IFN产生的抗病毒作用。共转染pcDNA3.1-HA-V和pRK-Flag-RIG-IN至HEK293T细胞和Huh7-p6细胞24h后加入商品化IFN-β（1000U/mL）和IFN-α-2b（1000U/mL）处理细胞，在24h后分别感染三种病毒，qPCR和WB检测表明V蛋白明显增加细胞中三种病毒mRNA的表达（p<0.05），说明PPRV V蛋白可显著抑制外源性IFN产生的抗病毒作用。
4.PPRV V通过阻断JAK-STAT途径抑制IFN的抗病毒作用。WB检测表明HEK293T细胞中转染pRK-Flag-RIG-IN增强IRF3磷酸化，转染pcDNA3.1-HA-V降低p369-IRF3和p701-STAT1磷酸化，表明PPRV V蛋白通过抑制JAK-STAT通路中IRF3和STAT1磷酸化减少IFN的产生。
5.构建了PPRV16153bp全长cDNA克隆及V基因突变全长cDNA克隆。根据PPRV基因组序列的保守性，在基因组3端引入锤头状核酶序列（the Hammerhead ribozyme sequence，HamRz），在5端引入T7终止子和丁型肝炎核酶序列（the Hepatitis delta virus ribozyme sequence，HdvRz），运用RT-PCR扩增出病毒7个片段，互相连接获得了全长cDNA克隆（pBluescript SK-PPRV）和V基因突变全长cDNA克隆（pBluescript SK-PPRV△V）。
本文研究了PPRV非结构蛋白V在宿主细胞内介导的天然免疫抑制机制，明确了V蛋白抑制RLRs通路中RIG-I介导的IFNs产生的基本分子机制，从而得出结论V蛋白在JAK-STAT途径中可抑制STAT1和IRF3磷酸化产生IFN的抗病毒作用，构建了PPRV全长cDNA克隆及V基因突变全长cDNA克隆，这些结果对进一步阐明PPRV非结构蛋白介导的天然免疫作用机制奠定了基础。