论文部分内容阅读
目的:当归四逆汤为《伤寒论》治疗血虚寒厥的方剂,用于治疗因寒诱发的各种神经病理性疼痛。前期研究证实,该方能够全面抑制温度敏感的TRP通道,治疗CCI模型造成的坐骨神经损伤,抑制冷痛、热痛和机械痛。本论文将进一步探讨该方中的寒凉药通草、白芍及其活性成分常春藤皂苷元、芍药苷镇痛效应及其机制,以期揭示该方中配伍寒凉药科学性、合理性,并探讨该方寒凉药镇痛的物质基础。方法:1.将64只SD大鼠随机分为8组,假手术组、模型组、普瑞巴林组、甲钴胺组、通草组、常春藤皂苷元组、白芍组及芍药苷组。假手术大鼠单纯暴露坐骨神经,其余大鼠均进行CCI结扎。假手术组大鼠每天以生理盐水灌胃,普瑞巴林组以10mg/kg·d·bid普瑞巴林灌胃,甲钴胺组以15mg/kg·d·bid甲钴胺灌胃,通草组以0.6356g/kg·d·bid通草灌胃,常春藤皂苷元组以10mg/kg·d·bid常春藤皂苷元灌胃,白芍组以0.9535/kg·d·bid白芍灌胃,芍药苷组以10mg/kg·d·bid芍药苷灌胃。分别在术前1天、术后1、4、7、14、21天均进行丙酮实验、热板实验及Von Frey实验。术后第21天,测试行为学后,麻醉后腹主动脉采血,取结扎处坐骨神经及L4-6 DRG神经元。对损伤处坐骨神经进行HE染色,用Elisa检测血清中IL6、IL1β、TNF-α含量,Western-blot检测DRG神经元中Artemin及TRP蛋白表达情况,PCR检测DRG神经元中Artemin、GFRα3、TRPV2和TRPV3 m RNA表达情况,对TRPA1、TRPV1、GFRα3进行免疫荧光。2.利用CCK8检测芍药苷及H2O2对Schwann细胞活性影响。在筛选合适的芍药苷浓度及H2O2损伤浓度基础上,将实验分成正常组（control）、模型组（model）、p38抑制剂组（SB203580）、芍药苷50μM组（PF 50）及芍药苷100μM组（PF 100）。SB203580及芍药苷于H2O2处理前24h预处理,除正常组外,所有组均给与含200μM的H2O2无血清培养基处理4h。利用ROS活性氧试剂盒检测各组内Schwann细胞ROS活性,利用Hoest33258观察Schwann细胞核凋亡情况,利用流式细胞仪检测Schwann细胞凋亡情况,PCR检测Bcl-2、Bcl-xl m RNA水平,Western-blot检测凋亡蛋白及TRP蛋白影响。结果:1.相较于假手术组大鼠,CCI大鼠从术后第4天开始出现明显的热痛敏、机械痛敏和冷痛敏（4、7、14、21d,P<0.05）;相较于模型组,所有药物术后第7天开始均能够缓解CCI大鼠热痛敏、机械痛敏和冷痛敏（7、14、21d,P<0.05）,普瑞巴林、甲钴胺、通草术后第4天能够缓解CCI大鼠的冷痛敏（P<0.05）;相较于假手术组,除了术后21天普瑞巴林组大鼠热痛敏能够恢复到正常水平,其余大鼠在术后4、7、14、21天均不能使冷痛敏、热痛敏及机械痛敏恢复到正常水平（4、7、14、21d,P<0.05）。2.相较于假手术组,CCI大鼠血清IL6、IL1β、TNF-α升高明显（P<0.05）。3.相较于模型组CCI大鼠炎症水平,普瑞巴林、甲钴胺、通草及白芍能够降低IL6、IL1β水平（P<0.05）,所有药物均能够降低TNF-α水平（P<0.05）,但只有普瑞巴林和甲钴胺能够使得IL6、IL1β、TNF-α恢复到正常水平。4.CCI术后21天,模型组中Artemin、TRPV1、TRPV4、TRPA1、TRPM8、p-p38MAPK的表达量升高,Artemin、GFRα3、TRPV2、TRPV3 m RNA表达量升高,TRPA1、TRPV1、GFRα3荧光强度增强。5.相较于模型组,所有药物均能够降低已升高的Artemin、TRPV1、TRPV4、TRPA1、TRPM8、p-p38MAPK的表达（P<0.05）;降低Artemin、GFRα3、TRPV2、TRPV3 m RNA表达量,降低TRPA1、TRPV1、GFRα3荧光强度。6.芍药苷能够保护Schwann细胞免于H2O2诱导的ROS升高和细胞核凋亡。7.预处理芍药苷和SB203580能够保护Schwann细胞避免H2O2诱导的的细胞凋亡。8.模型组中,抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl及其m RNA表达水平降低,促凋亡蛋白caspase3、c-caspase3、c-caspase7的表达量上升,p-p38MAPK表达量上升,以及凋亡相关蛋白TRPA1、TRPV1表达量升高。9.SB203580及芍药苷能够提高Bcl-2、Bcl-xl及其m RNA表达水平,降低caspase3、c-caspase3、c-caspase7,降低p-p38MAPK、TRPA1、TRPV1的表达。结论:1.Artemin、GFRα3、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPA1、TRPM8和p-p38MAPK与神经病理性疼痛密切相关;2.白芍、通草、芍药苷及常春藤皂苷元能够促进损伤坐骨神经的修复,缓解CCI大鼠的热痛敏、机械痛敏、冷痛敏;3.白芍、通草、芍药苷及常春藤皂苷元能够抑制p38MAPK磷酸化,进而抑制下游的TRP蛋白表达;4.白芍、通草、芍药苷及常春藤皂苷元能够抑制p38MAPK上游炎症因子和Artemin,进而抑制p38MAPK磷酸化;5.芍药苷能够通过抑制p38MAPK磷酸化调控下游凋亡蛋白及抗凋亡蛋白,进而保护Schwann细胞免于H2O2诱导的损伤和凋亡;6.白芍、通草、芍药苷及常春藤皂苷元通过抑制Artemin/GFRα3信号通路和抑制炎症因子的表达来调控TRPs。