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假单胞菌属东湖假单胞菌种HYS菌株是一株分离自武汉东湖水域的环境菌株。HYS菌株具备高产铁载体的能力,且在同等培养条件下对秀丽隐杆线虫表现出比人类机会致病菌铜绿假单胞菌PA14菌株更强的毒性。目前对于HYS的毒性机理研究较少,前期研究中已有证据表明HYS中存在Cbr/Crc参与到对线虫的毒性作用中,但并非唯一的毒性途径,暗示存在其他致病机制。东湖假单胞菌能高产7-羟基环庚三烯酚酮（7-Hydroxytropolone,7-HT）铁载体。7-HT除螯铁功能外,还具有抗真菌、细菌等生物活性。前期研究结果显示在线虫培养基中添加7-HT会影响线虫寿命,但是否为线虫的毒力因子还未有定论。本研究结合基因缺失突变株构建、细菌-线虫动物互作模型、荧光定量等技术方法检测了HYS菌株中7-HT对线虫的毒性,探讨泛酸代谢与7-HT合成的关系。对HYS菌株的线虫高致病性的原因进行探索,以评价泛酸代谢及7-HT合成在HYS菌株毒性中的作用。本研究从以下四个方面进行:一、HYS菌株中7-羟基环庚三烯酚酮的毒性。本研究主要从微生物遗传方面检测了7-HT对线虫的毒性。通过同源重组的方法构建了7-HT合成的缺陷株Δorf9。利用假单胞菌-线虫互作模型检测了Δorf9对线虫的慢性致死毒性,发现线虫的LT50（Median lethal time）增加至5.03±0.20 d,表明7-HT的合成缺陷株对线虫的毒性减弱。此外,Δorf9中添加终浓度为50μΜ的7-HT提取物,可以将突变株对线虫的LT50恢复至3.96±0.17 d,表明其毒性得到显著性恢复。添加终浓度30μM Fe SO4抑制7-HT合成后,喂食线虫的LT50提高至4.33±0.15 d。这些结果表明7-HT可作为一种细菌毒力因子参与到东湖假单胞菌HYS对线虫的慢性致死作用中。二、HYS中泛酸合成与对线虫的毒性相关性。为获取更多的毒性相关基因以得到7-HT的调控因素,本研究通过构建HYS转座子随机插入突变文库,从中筛选到了1株对线虫驱赶性大幅度减弱的突变株,通过分子生物学实验方法定位并获得pan B突变株。以泛酸合成突变株Δpan B喂食线虫的LT50显著性减弱至8.96±0.25 d。通过添加终浓度100μM的泛酸或回补pan B基因,均能恢复Δpan B对线虫的毒性。表明泛酸合成通路在HYS中对线虫的毒性起重要作用。确定HYS中泛酸代谢通过7-HT和pyoverdine合成影响对线虫的毒性。研究表明真菌中泛酸与铁载体合成具一定相关性,为研究在HYS中泛酸合成系统对铁载体产生的影响,首先检测NGM平板上Δpan B菌株产铁载体能力,发现泛酸合成突变株中荧光铁载体pyoverdine和非荧光铁载体7-HT产量均受限,且7-HT的合成关键基因orf9和调控基因orf1的转录水平在Δpan B菌株中均下调。这些结果表明在HYS菌株中泛酸合成突变会导致7-HT的产量受限,进而影响HYS对线虫的毒性。四、HYS中毒性因子筛选与验证。通过生物信息学比较分析,HYS基因组中存在多种其他假单胞菌属中保守的经典毒性相关基因。在线虫致病模型中,蛋白酶、氢氰酸、T6SS系统、运动性突变株均未表现出对线虫的毒性减弱的表型,表明上述多种经典的毒性基因在HYS的线虫慢性致死实验时不起作用。通过荧光定量筛选泛酸合成突变株中表达受影响的辅酶A相关基因,发现了琥珀酰辅酶A转移酶scot1的表达量显著提高。琥珀酰辅酶A转移酶突变株Δscot1喂食的线虫LT50为4.65 d。确定了琥珀酰辅酶A转移酶突变对线虫的毒性有显著影响。通过HPLC检测泛酸合成突变株中苯乙酸的积累,发现了泛酸合成突变株中苯乙酸积累造成HYS对线虫的毒性降低。这些研究说明HYS菌株对线虫的毒性有一定特殊性,除泛酸通过7-HT造成对线虫的毒性外,仍存在其他毒性因子有待发掘。综上所述,本研究通过微生物遗传学手段检测了HYS中7-HT的产生对线虫的毒性作用;发现了泛酸合成系统与对线虫的毒性密切相关;验证了泛酸合成系统可通过7-HT和pyoverdine合成参与到对线虫的毒性作用中;发现HYS中存在其它一些对线虫的毒性因子。初步探明了泛酸可通过影响铁载体合成参与到对线虫的慢性致死作用,为泛酸参与到细菌毒性作用的研究方向提供了思路,也为后续HYS中其他毒性因子研究的通路完善提供了方向。