目的：食管癌(esophageal carcinoma)是世界上常见的恶性肿瘤之一,在各种癌症死亡率中居第6位；每年新增患者超过30万人,并且大多发生于发展中国家。我国是世界食管癌高发地,尤其以河北磁县、涉县、河南林县、太行山区、苏北地区、大别山区、川北地区、潮汕地区以及新疆自治区哈萨克族聚居地为高发。食管癌居我国消化道恶性肿瘤发病率和死亡率的第二位,其病理类型以鳞状细胞癌为主,占发病率的90%左右。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAPs)是一类在结构上具有同源性的细胞内源性凋亡抑制蛋白家族。PED/PEA-15(phosphoprotein enriched in diabetes/phosphoprotein enriched in astrocytes)是一种具有广谱抗凋亡功能的小分子蛋白质,1998年在2型糖尿病患者的组织中克隆出来,研究发现其与信号转导、凋亡、ERK的激活和葡萄糖转运等多种细胞进程有关。因其特殊的分子结构及抑制细胞凋亡的功能,并可能作为靶蛋白为肿瘤的诊断及治疗开辟新途径而日益引起人们的关注。Caspase-3(CPP32,apopain)是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路。Caspase-3介导的凋亡在生物体细胞中普遍存在,在多种刺激因素的作用下,启动信号可以激活Caspase-3,使胞质、胞核及细胞骨架的重要蛋白质降解失活,因此科学界认为Caspase-3是哺乳动物细胞凋亡中的关键酶。PED/PEA-15广泛存在于细胞质中,大小为15kDa,位于常染色体1q21-22,是PKC(Protein kinase C,蛋白激酶C)途径中PEA-1(phosphoprotein enriched in astrocytes,星型胶质细胞浓缩磷蛋白酶)的底物。PED/PEA-15以两种分化的剪接体存在于细胞中,大小分别为2.8和1.7kb,分别与clone1和clone4相对应。有研究发现,PED/PEA-15能够阻断Caspase的作用,从而使肿瘤细胞逃避细胞凋亡。研究表明,PED/PEA-15在多种肿瘤细胞中高表达,包括肺鳞癌、喉癌、前列腺癌等。其表达水平与肿瘤的性质、分化程度、预后、肿瘤的演进过程及放化疗有关。本实验检测了PED/PEA-15蛋白在人食管癌组织中的表达情况,分析了其与食管癌临床病理特征的关系,结合随访资料探讨了其表达的意义及与预后的关系。选取食管癌细胞系TE1、TE2、TE10、T-Tn、Yes2、Yes4、 Yes6,检测PED/PEA-15在细胞系中的表达,并选取TE1作为研究对象,建立PED/PEA-15质粒转移细胞系及PED/PEA-15基因沉默细胞系。观察其对细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响,并检测Caspase-3在不同细胞系中的表达。探讨PED/PEA-15在Caspase-3凋亡通路中的作用,采用ADR(阿霉素)作为干扰剂,诱导凋亡。以期揭示PED/PEA-15抑制食管癌细胞凋亡、调控细胞周期的可能分子机制。通过构建癌裸鼠移植瘤模型,观察PED/PEA-15对荷瘤裸鼠肿瘤生长的促进作用,研究其作为食管癌基因治疗靶点的可能性,为PED/PEA-15(?)抑制剂应用于肿瘤的临床治疗提供理论基础及实验依据。方法：1食管癌组织中PED/PEA-15蛋白的表达及其意义收集河北医科大学第四医院胸外科2005年手术的食管鳞状细胞癌住院患者的病理组织腊块85例。男性患者54例,女性患者31例,男女比为1.74/1,病人平均年龄为57.1岁。食管胸上段癌11例,中段癌51例,下段癌23例。术前术后未行放化疗,术后随访资料完整,连续随访5年以上。对照组：2005年1月—2005年12月行胃镜和食管镜检查的食管良性病组织90例。免疫组织化学方法联合检测85例食管癌组织及90例正常食管组织中PED/PEA-15蛋白的表达,分析其与食管癌临床病理特征的关系,并结合随访资料探讨它们在食管癌中表达的意义及预后价值。结合免疫组化结果,检测食管癌细胞株TE1、TE2、TE10、T-Tn、Yes2、Yes4、Yes6中PED/PEA-15的表达。2PED/PEA-15基因沉默对食管癌细胞凋亡的影响选取体外培养的人食管癌细胞株为研究对象,利用RT-PCR法扩增出PED/PEA-15的全长基因,构建PED/PEA-15的真核表达载体,并将之转染至食管癌细胞株中,观察PED/PEA-15的表达对食管癌细胞凋亡的影响；通过转染PED/PEA-15特异性shRNA(短发夹RNA)敲除TEl细胞中的PED/PEA-15基因,抑制内源性的PED/PEA-15基因的表达,观察其对凋亡的影响并分析可能的原因,探讨其可能的作用机制。采用ADR(阿霉素)作为干扰剂,诱导凋亡,并通过检测Caspase-3研究细胞凋亡的变化。以不含胎牛血清的RPMI-1640培养基常规培养人食管癌细胞株TE1。采用Western-blot法检测转染PED/PEA-15及PED/PEA-15shRNA的TE1细胞株细胞凋亡的变化；流式细胞术(FCM)及TUNEL凋亡实验测定细胞周期变化及细胞凋亡率；提取不同药物浓度及作用时间的细胞总蛋白,Western blot检测蛋白的表达变化。3稳定表达PED/PEA-15基因TE1细胞荷瘤小鼠肿瘤生长的观察培养稳定转染PED/PEA-15基因的食管癌TE1细胞株及未经转染的TE1细胞株,各取4×106个细胞悬液接种于BALB/c-nu/nu裸小鼠的左侧下腹部部皮下构建食管癌细胞裸鼠移植瘤。10只裸鼠随机分为实验组和对照组(每组5只)。实验组接种PED/PEA-15稳定转染细胞,对照组接种未经转染的细胞。饲养30天后处死,取瘤块称重。实验过程中每隔3天测量肿瘤的最长径(a)和最短径(b),计算裸鼠移植瘤体积：V=a*b2/2,绘制肿瘤生长曲线,计算重量抑瘤率和体积抑瘤率。HE染色光镜下观察移植瘤形态学变化；FCM测定细胞周期变化及细胞凋亡率。结果：1食管癌组织中PED/PEA-15蛋白的表达及其意义PED/PEA-15在食管鳞状细胞癌组织中的阳性表达率为58.8%,食管良性病组织中阳性表达率为33.3%,食管远癌组织中为45.9%。统计学分析显示,三者的表达差异有统计学意义(P<0.05)。研究显示85例食管鳞癌组织中PED/PEA-15阳性表达共50例,总的阳性表达率为58.8%。分布为：男性60.0%,女性40.0%；年龄60岁以上患者36.0%,60岁以下患者64.0%；肿瘤位于食管上段者14.0%,中段者62.0%,下段者24.0%。统计学分析显示,PED/PEA-15的表达与性别、年龄、肿瘤部位均无相关性,组间差异无统计学(P>0.05)。PED/PEA-15的阳性表达者中组织低分化有6例(12.0%),中分化有35例(70.0%),高分化有9例(18.0%)；食管癌原发肿瘤的侵润至粘膜层及粘膜下层者有2例(4.0%),深肌层者有13例(26.0%),纤维膜者有35例(26.0)；无淋巴结转移者5例(10%),有淋巴结转移者45例(90%)。统计学分析发现,PED/PEA-15的表达与原发肿瘤组织分化程度、侵润深度、有无淋巴结转移均有密切关系(均P<0.05)。PED/PEA-15的阳性表达率越高,患者五年生存率越低(P<0.05)。PED/PEA-15的mRNA在不同类型食管癌细胞株中的表达：TE1细胞株(1.439±0.605)、TE2细胞株(1.141±0.497)、TE10细胞株(1.338±0.588)、T-Tn细胞株(1.501±0.091)、Yes2细胞株(1.360±0.660)、Yes4细胞株(1.275±0.437)、Yes6细胞株(1.112±0.360)各组表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。2PED/PEA-15基因沉默对食管癌细胞凋亡的影响本研究对七株食管癌细胞株：TE1、TE2、TE10、T-Tn、Yes2、Yes4、 Yes6,采用RT-PCR法检测了细胞株mRNA,结果显示组间差别无统计学意义(P>0.05), Western-blot检测表明细胞株之间的蛋白表达量有差别。我们挑选了2株转染效果较好的食管癌细胞株TE1和T-Tn,检测了外源性PED/PEA15-15基因对食管癌细胞增殖的影响,结果显示随着PED/PEA-15基因的表达水平增高,细胞增殖加快。MTT结果显示,转染PED/PEA-15的TE1细胞和T-Tn细胞,能够促进细胞的增殖,且具有时间剂量依赖性,细胞增殖率IR(χ±s)%：TE1转染组浓度为2μg时与对照组相比,12h、24h、48h时均无显著差别(P>0.05)；60h时,与对照组有显著差别(P<0.05)；转染组浓度为4μg与对照组相比,12h、24h无显著差别(P>0.05)；48h、60h时,与对照组有显著差别(P<0.05)。T-Tn转染组浓度为2μg时与对照组相比,12h、24h、48h时无显著差别(P>0.05),60h时,与对照组有显著差别(P<0.05)；转染组浓度为4μg与对照组相比,12h无显著差别(P>0.05)；24h、48h、60h时,与对照组有显著差别(P<0.05)。加入ADR(阿霉素)以后,随着ADR作用时间的延长,Western-blot结果显示TE1细胞株中的PED/PEA-15蛋白水平表达降低,组间差别有显著意义(P<0.05),同时我们利用Caspase凋亡试剂盒检测细胞凋亡,发现Pro caspase-3蛋白在ADR的参与下表达并无明显变化,而Caspase-3被激活裂解,表明在ADR的作用下细胞凋亡活性增加,PED/PEA-15的作用被抑制。TEl食管癌细胞中分别转染空载体质粒和外源性的PED/PEA-15基因,在相同的ADR处理条件下,Western-blot结果显示空载体转染组Caspase-3被激活说明细胞凋亡,而PED/PEA-15转染组,细胞无凋亡,组间差别有统计学意义(均P<0.05)。说明PED/PEA15蛋白抑制肿瘤细胞的凋亡。PED/PEA-15基因沉默对TE1细胞凋亡的影响：TUNEL细胞凋亡的实验结果显示PED/PEA-15基因敲出后TE1细胞凋亡明显增加。FCM检测凋亡,结果显示：PED/PEA-15shRNA组凋亡率(19.53±0.80)%显著高于对照组(9.83±1.34)%(P<0.01)。提示PED/PEA-15基因沉默可以使TE1细胞的凋亡活性增强,表明PED/PEA-15具有凋亡抑制作用。Western-blot结果显示：经ADR处理两组细胞株后,转染PED/PEA-15特异性shRNA组细胞株的凋亡增加,Caspase-3活性增强,组间差别有统计学意义。3稳定表达PED/PEA-15基因TE1细胞荷瘤小鼠肿瘤生长的观察成功构建人食管癌裸鼠移植瘤模型,成瘤率达100%。实验结束时,实验组移植瘤的体积及重量均明显大于对照组(P<0.05),体积抑瘤率为-175%,重量抑瘤率为-78.6%；与对照组相比,实验组移植瘤细胞凋亡率明显降低(7.03±1.63)%,Go/G1期细胞比例显著降低,S期细胞比例明显升高(P<0.05)。结论：1PED/PEA-15在人食管鳞状细胞癌组织中高表达,并且与肿瘤的侵润深度、肿瘤细胞分化程度及有无淋巴结转移均有密切关系。PED/PEA-15与食管癌的预后有直接关系,能够作为判断食管癌预后的指标。2PED/PEA-15在不同食管癌细胞株中均有表达,且表达无显著差异。PED/PEA-15基因对食管癌细胞的增殖有影响,随着PED/PEA-15基因的表达水平增高,细胞增殖加快。3高表达PED/PEA-15对食管癌细胞株凋亡有抑制作用。PED/PEA-15基因表达沉默,能抑制食管癌细胞的增殖,并促进其凋亡。PED/PEA-15有望作为食管癌基因治疗的有效靶点4体内试验证明,PED/PEA-15能够促进人食管癌细胞株TE1裸鼠移植瘤的生长。PED/PEA-15的促瘤作用是通过促进肿瘤细胞增殖,抑制凋亡并导致细胞发生Go/G1期加速而实现的,其机制可能是通过阻止caspase的激活来实现的。