泛素化是一种广泛分布在细胞中的重要的蛋白质翻译后修饰系统。修饰分子-泛素(Ub)是一种分子量为8.5k Da的小蛋白。一个泛素分子本身的8个氨基酸位点(Met1,Lys6,Lys11,Lys27,Lys29,Lys33,Lys48,和Lys63)也可被其他泛素分子修饰进而形成8种多聚化泛素链。M1型泛素链(又称线性泛素链)是一个泛素分子通过其C端Gly76的α羧基与另一泛素分子N端第一位Met的α氨基形成肽键,进而形成多聚M1型(线性)泛素链分子。M1型泛素链对细胞内多种蛋白的修饰在先天性免疫、肿瘤的发生、炎症的发展、神经退行性疾病等生理过程中发挥着不可或缺的作用。目前,泛素化修饰物的分离方法主要有三种:一是,应用抗特定类型泛素链的抗体亲和并分离泛素化蛋白质组;二是,使用胰酶水解泛素化的靶蛋白后进而产生特征性肽段(K-?-G-G),再应用亲和此肽段的抗体分离、分析泛素化组;三是,应用重组的泛素识别结构域的串联蛋白链进行亲和并分离泛素化的蛋白组。这些方法都各具优缺点,其中最主要的问题是不能针对特定类型与长度的泛素链进行分离分析。而对于线性泛素修饰底物的分离分析的方法目前主要是通过细胞内过表达LUBAC(线性泛素链组装复合体)配合去泛素化酶OTULIN进行分析;另外,通过体外三级酶联反应可直接合成不同长度泛素链。有报道通过基因工程手段构建非天然结构的M1型泛素链基因的方法。通过这些策略制备的M1型泛素链都不能具备特定的长度,或不具有天然连接方式,也就不能真实地体现细胞内天然链修饰的机制。因此,制备具备天然链接结构的、确定长度的M1型泛素链基因是本领域急需的重要研究材料。本研究根据泛素的基因序列特性,发明了一种全新的M1型泛素链基因的体外构建策略。泛素第75与第76位Gly的编码序列为“GGAGGC”,我们在第一条泛素基因的下游添加碱基CT,形成了限制酶Stu I的酶切位点“AGG│CCT”,将此改造的Ub基因克隆入p ET22b载体,经过Stu I切割后,其末端变为平末端“GGAGG”,进而构建成“p ET22b-Ub-GGAGG”。在设计第二条Ub基因时,我们构建了一条在Ub基因序列5’端额外添加一碱基C且同样为平末端,而3’端依旧带有额外碱基CT的单泛素基因片段“C-Ub”,将此片段插入“p ET22b-Ub-GGAGG”,即可获得阅读框完整,并且能够继续进行循环构建,不断延长的M1型泛素链基因。结果显示,循环插入“C-Ub”后都能成功获得更长的M1型泛素链基因,且相邻泛素基因间无冗余核苷酸,链接为天然方式。本研究最终构建了2～8个泛素长度的M1型泛素链基因的原核与真核表达载体,证明了应用此策略的可行性。应用原核表达系统对构建的M1型泛素链基因进行了表达、纯化及活性鉴定。结果发现,不同长度的M1型泛素链基因均可在大肠杆菌中大量表达,并且表明OTULIN能够水解除Ub1-GST外的其他M1型泛素链;抗M1型泛素链的专一性抗体也能够辨识除Ub1-GST外的其他M1型泛素链。这些结果证明利用本研究中的构建策略制备的M1型泛素链蛋白具有天然的链接方式和完全的天然活性。可以用于细胞内外修饰功能的研究。荧光检测显示在真核细胞中M1型泛素链基因能正常表达。利用亲和标签的Pull-Down实验显示,外源表达的M1型泛素链能对内源蛋白发挥修饰功能;一些被修饰的靶蛋白可从总蛋白中提取分离且能被OTULIN水解;不同长度的M1型泛素链的修饰情况各有不同。细胞活力检测结果显示,转染了M1型泛素链基因的细胞的活力无显著下降,也并未发生显著的凋亡。进一步应用所获得的M1型泛素链蛋白筛选了具有一定亲和活性的核酸适配体。总之,应用本研究发明的M1型泛素链基因的新构建策略,获得了7种长度的M1型泛素链基因与相应的蛋白,这些M1型泛素链蛋白具有正常活性和天然的链接,并适用于适配体候选物的筛选。M1型泛素链基因成功在哺乳动物细胞内表达,且对细胞活力无显著影响,表达的M1型泛素链可对内源蛋白进行功能性修饰,并可进行修饰组的体外分离。本研究中提供的构建策略与结果为进一步研究线性泛素链、线性泛素化底物及其参与的信号通路提供了重要的方法、材料与模型。