论文部分内容阅读
热稳定性是功能蛋白储存和使用的重要限制因子,特别对酶蛋白来说至关重要。许多商业酶因耐热性不能达到工业生产的热处理条件(通常超过45℃)而无法被采用。另外,植物中与光合作用有关的关键酶也受高温抑制,从而导致农作物产量下降。因此,对酶蛋白进行分子改良以提高其热稳定性,进而提升其功效和扩大其应用范围,具有重要的现实意义。目前用于蛋白质分子改良以提高其热稳定性的分子生物学手段主要有两种:一种是化学工程策略(即化学修饰),另一种是基因工程策略(DNA突变和蛋白融合策略)。其中,蛋白融合策略已成为近年来提高目标蛋白可溶性和热稳定性的重要手段,并主要取决于具有明显功效的融合标签或接头。因此,本工作选取三种热稳定性差、易聚集但具有重要功能的酶蛋白(小桐子抗坏血酸过氧化物酶1即JcAPX1、大肠杆菌高丝氨酸-O-转琥珀酰酶即EcMetA、假单胞菌亚磷酸盐脱氢酶即PsPtx)作为靶蛋白,以检验来自超噬热菌Pyrococcus furiosus的小分子量红素氧还蛋白(Rubredoxin)即PfRub能否作为热稳定性融合接头,提高大肠杆菌重组表达靶蛋白的可溶性、热稳定性及其活性耐热能力。取得的主要结果如下:(1)融合接头PfRub的基因合成及其原核融合表达载体的构建首先通过引物互补延伸法合成PfRub的DNA片段,纯化后经Sal I和Xho I双酶切,分别插入到载体pET(JcAPX1)、pET(EcMetA)、pET(PsPtx)上靶蛋白基因3’端后的Xho I位点,构建了三种原核融合表达载体并通过测序验证。(2)融合PfRub可提高JcAPX1的可溶性、热稳定性及其酶活耐热性由SDS-PAGE的结果可以看出C-端融合PfRub可将JcAPX1的可溶性由12%提高到94%左右。从热稳定性分析的结果可以看出,融合PfRub能显著增强重组JcAPX1的热稳定性。同时,JcAPX胶活性染色和分光光度法酶活测定的结果表明,融合PfRub还能使JcAPX1的酶活耐热能力至少提高了3℃。(3)融合PfRub可提高EcMetA的可溶性和热稳定性及其重组大肠杆菌的耐热性同样,C-端融合PfRub能有效提高EcMetA的可溶性(至少提高了20%)和热稳定性。另外,由细菌梯度稀释点板实验发现,在高温(42℃、48℃、52℃)胁迫2 h后,EcMetA-PfRub重组大肠杆菌在M9基本培养基上的菌落生长状况明显好于含单独EcMetA的重组菌,表明融合PfRub还能有效提高EcMetA重组大肠杆菌菌株的耐热性。(4)融合PfRub可提高PsPtx的可溶性、热稳定性和酶活耐热性由SDS-PAGE分析结果可以看出,C-端添加PfRub接头显著增强了重组PsPtx蛋白的可溶性和热稳定性。同时,从胶活性染色结果可以看出,PfRub接头的添加还能有效保护PsPtx免遭热失活,而且通过更灵敏的分光光度法酶活测定分析证实可以使PsPtx的酶活耐热性至少提高12℃。综上,PfRub作为融合接头不仅能提高靶蛋白的可溶性和热稳定性,而且能保护靶蛋白免遭热失活并赋予其重组菌更好的耐热性。PfRub来自于超噬热菌Pyrococcus furiosus,它的这种热稳定作用可能归因于它本身超高的热稳定性及其对融合靶蛋白的分子内顺式传递。因此,本工作看来为采取融合策略提高目标蛋白的热稳定性及其应用方面提供了一条新的有效途径。特别提及的是,这种方法应该也适用于植物转基因研究,为提高植物耐高温胁迫提供了可能。