环境因子对斑马鱼转座子活性的影响

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近十多年来,表观遗传学研究越来越受到重视,人们对环境与基因组间存在互作的观点逐渐认同,但对环境与基因组互作机制的理解和认识仍然比较模糊。转座子从上世纪50年代被发现到开始的前几十年一直被认为是对基因组无用的垃圾序列,假基因。然而随着越来越多的物种全基因组测序结果的揭示,人们发现转座子是大多数生物基因组的重要组成成分,在基因组进化和功能上发挥着重要的作用,且很多生物基因组中均存在着活性转座子。因此,生物很可能通过基因组上的这些活性转座子实现基因组对环境变化的响应,即环境变化影响转座子活性,调控转座的发生,进而产生新的变异,适应新的外界环境。然而,现有关于环境对转座子活性影响的研究鲜有报道。本文通过生物信息学方法对9种硬骨鱼基因组的转座子成份进行了注释,进行了物种间比较分析,并挖掘潜在的活性转座子,在此基础上以斑马鱼为实验动物,分析部分代表性DNA和RNA转座子的时空表达特性,并研究环境污染物包括二嗯英类有机物(TCDD)和重金属对这些转座子活性的影响。主要结果如下:1.通过生物信息学手段,使用RepeatModeler和LTRharvest、MGEScan-nonLTR等转座子注释软件,对九种硬骨鱼基因组转座子进行鉴定、识别和分类分析,最后结合筛除假阳性操作,分析结果表明九种硬骨鱼基因组中分布着扩增丰富的Ⅰ类和Ⅱ类转座子,不同物种间扩增情况差异显著,且这种差异与基因组的大小存在一定的关联:在基因组较大的硬骨鱼中,鉴定到的转座子占基因组比例往往较大,如矛尾鱼(2700Mb)中41.69%、斑马鱼(1330Mb)中54.96%;在基因组较小的物种中,转座子所占比例也较少,如金娃娃(347Mb)中占5.89%、红鳍东方鲀(381Mb)中2.94%。转座子的家族分化也极其丰富,在九种硬骨鱼中鉴别出几乎已知所有存在于硬骨鱼上的转座子家族。2. 为了研究转座子的时空表达特征,将我们鉴定出的九个疑似活性转座子代表包括:Tc1家族DNA转座子(Tc-a、Tc-b、Tc-c、Tc-d、Tc-e)、反转录病毒转座子(ZB-ERV-1、 ZB-ERV-2)、反转录LINE转座子(L1-323、L1-21)的序列,合成引物用于实时荧光PCR检测;分别收集斑马鱼早期发育节点:0.75hpf、2hpf、3hpf、6hpf、15hpf、24hpf及48hpf的胚胎,提取总RNA,反转录cDNA;解剖12月龄成年斑马鱼,分别取出心脏、大脑、肌肉、肝脏、睾丸和卵巢,提取RNA,反转录cDNA,用上述引物研究转座子在斑马鱼早期发育阶段的mRNA水平变化及斑马鱼组织上的表达差异。结果表明:早期发育阶段DNA转座子(除Tc-d外)在包括3hpf及之前的发育时期没有检测到mRNA的表达,后期呈现出一种先下降后上升的趋势,而RNA转座子随着发育时间的延长一直呈现出上升的趋势;在组织表达中,可以看出转座子在大脑和心脏中的表达都要显著高于其它组织,在睾丸中的mRNA表达水平最低。3. 为了研究环境应激与转座子活性水平的互作影响,收集斑马鱼胚胎孵育2h,用5nM的四氯二苯并-p-二恶英(TCDD)侵染胚胎两小时,然后换回新鲜的E3培养液培养到72h,收集胚胎,提取RNA反转录cDNA,以DMSO组为对照;使用Cu2+和Cd2+在斑马鱼受精0.5h时,分别以5 μmol/L和30 μmol/L的浓度诱导斑马鱼胚胎至24hpf,使用新鲜E3溶液继续培养到72h,提取RNA反转录cDNA,使用上述合成的引物进行实时荧光PCR检测,分别研究环境污染物二噁英(TCDD)和重金属对生物体转座子在mRNA水平活性的影响。结果表明,整体上TCDD抑制了转座子(除ZB-ERV-2外)的表达,其中四个Tc-1家族的DNA转座子和一个反转录病毒转座子显著抑制。ZB-ERV-2在经处理之后表达水平显著上调。转座子活性经过重金属暴露实验之后,DNA转座子表达水平普遍上调,其中镉处理使得Tc-b转座子表达水平下降,同时还抑制了3个RNA转座子,对L1-323的表达具有显著上调的作用,铜处理使得ERV转座子(ZB-ERV-1, ZB-ERV-2)被抑制,其中ZB-ERV-1表达水平显著下调,而LINE转座子则被显著上调了表达。总体上,本研究注释了9个硬骨鱼基因组中转座子的分布情况,并进行了不同物种间的比较分析,揭示了9种硬骨鱼基因组上的转座组差异,并在模式生物斑马鱼上系统研究了9个疑似活性转座子的时空表达特征,分析了环境因子TCDD和重金属暴露对斑马鱼早期胚胎的转座子活性的影响。研究结果揭示了硬骨鱼基因组中转座子的分布情况和组成特征,为更好理解硬骨鱼类的进化关系提供了重要的参考,同时揭示了环境变化对基因组稳定性产生影响的可能分子机制。
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