许氏平鲉精子超低温冷冻保存、人工授精技术开发及高密度遗传连锁图谱构建

来源 :上海海洋大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:birchwoods2010
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许氏平鲉(Sebastes schlegelii)肉质鲜美、富含多种蛋白质、具有较高的营养价值,深受北方沿海居民的喜爱。其具有洄游范围小、繁殖能力强、在北方海域可以自然越冬等优点,现已成为我国北方沿海网箱养殖、增殖放流的重要经济鱼种。许氏平鲉是典型的卵胎生鱼类,生殖周期长,存在苗种获得困难、良种选育难度大等问题,同时随着许氏平鲉养殖产业的进一步发展,养殖企业对优质种苗的需求日益增加,如何稳定获得大量优质苗种以及加快良种选育进程是目前许氏平鲉产业健康发展亟待解决的问题。本研究首先对许氏平鲉精子进行超低温冷冻保存研究,以精子复苏率与精子相关酶活性为评价冷冻保存精子质量的指标,初步探索出许氏平鲉精子超低温冷冻的方法,为其他卵胎生鱼类精子的冷冻保存提供参考;其次,本研究首次将冷冻复苏后的许氏平鲉精子用于人工授精研究,通过人工受精技术成功构建许氏平鲉杂交F1群体,并利用SSR标记对其进行亲子鉴定,为后续遗传连锁图谱的构建以及人工选育提供新的思路;以许氏平鲉杂交F1群体为构图群体,通过RAD-seq测序技术在许氏平鲉全基因组范围内开发SNP标记,完成许氏平鲉高密度遗传连锁图谱的构建,为许氏平鲉分子辅助育种以及后续基因组学研究提供参考。1.许氏平鲉精子超低温冷冻保存及酶活性检测为建立卵胎生经济鱼类许氏平鲉精子超低温冷冻保存方法,本研究以HBSS、MPRS、Cortland、Ringer,s和TS-2作精子稀释液,添加不同体积浓度(5%、10%、15%、20%和25%)的二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甲醇(MEOH)和丙三醇(Gly)作为抗冻剂对许氏平鲉精子超低温冷冻保存效果进行研究,通过对冻精和鲜精的ATP酶、琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)等6种酶活性的测定对冻精质量进行评价。结果显示:HBSS+20%DMSO、TS-2+15%DMSO和TS-2+15%EG等3组混合液作精子抗冻保护液时,许氏平鲉精子复苏率显著高于其他组(P<0.05);除GR酶外,鲜精中总ATP酶、SDH、LDH、CK、CAT酶活性均显著高于添加抗冻液组(P<0.05)。总体来说TS-2+15%EG组合冷冻保存精子效果最好,可用于后续许氏平鲉精子冷冻保存。2.许氏平鲉人工授精技术开发及全同胞家系建立与鉴定为建立许氏平鲉人工授精方法,利用HBSS+20%DMSO、TS-2+15%DMSO以及TS-2+15%EG三组精子冷冻保存最优组合保存许氏平鲉精子(冷冻时间>48h),生理盐水组作对照,冻精组精子冷冻复苏后用于人工授精实验,统计受精成功率,并利用微卫星标记对产出的后代进行亲子鉴定。结果显示,TS-2+15%EG组受精成功86.7%,均显著高于HBSS+20%DMSO组(14.4%)和TS-2+15%DMSO组(44.4%)(P<0.05),表明可以用TS-2+15%EG组合用于许氏平鲉精子冷冻保存后的人工授精。微卫星进行亲子鉴定,显示人工授精获得的后代仔鱼与雌雄亲本均具有亲权关系。本研究首次对许氏平鲉进行人工受精实验研究,初步探索出许氏平鲉人工授精方法,有效解决了当前利用野生孕期雌性亲鱼进行繁殖的窘境,为许氏平鲉苗种繁育、人工选育及种质资源保存提供技术支撑。3.许氏平鲉RAD-seq测序及SNP标记开发本研究利用人工受精技术构建的杂交F1群体(共130个样本,包括2个亲本和128个子代样本),进行RAD-seq测序,群体检测获得原始SNP标记4,181,251个,其中只在父本中杂合的SNP标记192,038个,只在母本中杂合的SNP标记195,534个。以比对质量值≥20,深度≥4为标准,筛选获得SNP标记2,609,342个,对上述SNP标记进一步筛除缺失率大于10%,最小等位基因频率低于5%的位点,得到SNP标记65,603个。为后续遗传连锁分析,采用卡方检验,对上述65,603个候选SNP标记进行偏分离过滤,偏分离设定的阈值P为0.05,挑选双亲拟测交位点(“hk×hk”、“nn×np”、“lm×ll”),同时经过偏分离分析,最终筛选出高质量SNP标记共40,155个。本研究通过RAD-seq测序技术获得大量高质量的SNP标记,为后续遗传连锁分析奠定基础。4.许氏平鲉高密度遗传连锁图谱的构建在人工授精技术构建的杂交F1群体随机挑选128个样本,以2个亲本和128子代个体为作图群体,完成许氏平鲉高密度遗传连锁图谱的绘制,遗传图谱具有较高的SNP标记密度,共有24个连锁群,与许氏平鲉单倍体染色体数目相同。雌性图谱中包含21,725个SNP分子标记,图谱总长2070.22c M,标记间平均间隔为0.04-0.27c M;雄性遗传连锁图谱总长1915.24c M,共24,022个SNP标记,标记间的平均间隔为0.05-0.14c M;整合图谱包含40,131个SNP分子标记,总长为2080.03c M,图谱覆盖率高达99.86%,完整性较高。许氏平鲉高密度遗传连锁图谱的构建为后续重要性状的QTL定位分析、基因组学研究以及分子标记辅助育种提供了良好素材。
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