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人类对能源的需求不断增加,传统化石能源日益枯竭,寻找和开发新的、清洁的、可再生能源（太阳能、风能和生物质能等）已成为人类共识。乙醇作为大宗生物发酵产品,已被公认为是最具潜力的可再生清洁能源之一。目前第一代生物燃料乙醇主要由酿酒酵母或运动发酵单胞菌利用糖/淀粉类（甜菜、玉米和高粱等）等粮食作物或经济作物的水解液发酵生产,因而造成了与人争粮、与粮争地的问题。以藻类为原料的第三代生物燃料乙醇目前仍处于实验室阶段。因此以农业废弃物和木质纤维素为原料的第二代生物燃料乙醇最具发展前景。嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacterium aotearoense SCUT27）发酵主产物为乙醇、乳酸、乙酸、CO2以及H2,具有代谢速度快、水解纤维素能力强、戊糖转化率高、底物利用范围广等优势,利用其进行纤维素乙醇的高温发酵,有望实现木质纤维素的同步降解和乙醇发酵同步进行,从而最大限度降低纤维素乙醇的生产成本。但T.aotearoense SCUT27仍存在发酵副产物较多、乙醇得率不高以及菌株对乙醇耐受性弱等缺点。因此,提高嗜热厌氧杆菌的乙醇生产能力和乙醇的耐受性具有重要意义。醛醇脱氢酶（Acetaldehyde/alcohol dehydrogenase,AdhE）是双功能酶,催化乙酰辅酶A还原为乙醛和乙醛还原为乙醇,两种还原反应以烟碱酰胺辅因子（NADH和NADPH）作为电子供体。AdhE在嗜热菌中不仅参与乙醇产生,还参与乙醇调控,是乙醇代谢途径中的关键酶。课题组前期成功敲除乳酸脱氢酶基因（ldh）,获得工程菌T.aotearoense SCUT27/△ldh,本文在此基础上过表达adhE基因。SDS-PAGE以及酶活测试证实adhE实现过表达。工程菌SCUT27/△ldh/adhE在血清瓶中分别以葡萄糖、木糖和混合糖（G:X=2:1）为碳源发酵时,与出发菌SCUT27/△ldh相比,工程菌的乙醇产量分别提高24.3%、19.9%和9.1%,乙醇得率分别提高24.2%、8.8%和11.4%。突变株以葡萄糖为碳源在发酵罐中进行游离细胞补料发酵,其乙醇产量和生产速率分别达到了36.17 g/L和0.35 g/L·h,比出发菌提高了43.8%和20.7%。SCUT27发酵产物乳酸、H2及目标产物乙醇的代谢均需要辅因子NADH,本论文在乳酸途径缺失突变株△ldh基础上,阻断副产物H2的代谢途径,使更多的还原力流向乙醇途径。嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacterium aotearoense SCUT27）中氢气生产主要由三个氢化酶（Hyd、Ech和HfsB）催化。分别敲除SCUT27/△ldh中以上三个氢化酶,发现工程菌SCUT27/△ldh/△hfsB氢气产量下降最为显著,不同发酵时间段SCUT27/△ldh/△hfsB胞内还原力水平均高于SCUT27/△ldh,并且△hfsB突变株的ADH酶活以及乙醇代谢相关基因adhE、adhA和pfor的表达量均有显著提高。在血清瓶中以葡萄糖、木糖和混合糖（G:X=2:1）为碳源为底物发酵时,与出发菌SCUT27/△ldh相比,工程菌SCUT27/△ldh/△hfsB的乙醇产量和得率分别提高28.5%、62.7%、24.1%和18.2%、32.4%、20%,乙酸产量分别下降19.6%、18.4%和19.6%。在发酵罐中以葡萄糖为碳源进行游离细胞补料发酵,其乙醇产量和生产速率分别达到了39.64 g/L和0.41 g/L·h,比出发菌提高了57.6%和36.7%。同时乙酸产量为7.38 g/L,比出发菌降低了26.6%。基于不同浓度乙醇刺激的T.aotearoense SCUT27/△ldh转录组数据,选取在高乙醇刺激下显著上调的四个基因（metY,thiS,ABC.SN.A,ABC.SN.P）为研究对象,以期获得高乙醇耐受性突变株。SDS-PAGE证明四个基因均成功实现在SCUT27/△ldh中的过表达,工程菌耐受乙醇的能力为△ldh/metY>△ldh/ABC.SN.A>△ldh/ABC.SN.P>△ldh/thiS>△ldh。选择耐受性能最佳的突变株SCUT27/△ldh/metY进行摇瓶发酵测试,发现尽管其乙醇耐受性提升但乙醇产量未有明显改变。在发酵罐中以葡萄糖为碳源进行游离细胞补料发酵时,突变株SCUT27/△ldh/metY与出发菌T.aotearoense SCUT27/△ldh相比,产率没有改变（0.33±0.01 g/g vs 0.33±0.01 g/g）,但乙醇产量提高23.5%（31.07±0.88 g/L vs25.15±0.45 g/L）。此外,还对SCUT27/△ldh/adhE、SCUT27/△ldh/metY和SCUT27/△ldh/△hfsB三株工程菌对木质纤维素水解液的利用能力进行了初步研究。本文选取了大豆皮（SHH）,小麦秸秆（WSH）,玉米芯（CCH）和玉米秸秆（CSH）水解液为底物（总糖约为25g/L）对三株工程菌进行发酵测试,发现其乙醇产量均优于出发菌株SCUT27/△ldh,其中SCUT27/△ldh/adhE利用大豆皮产乙醇优势明显（9.00 g/L vs 7.01 g/L）,而SCUT27/△ldh/△hfsB利用玉米芯水解液优势明显（8.93 g/L vs 7.73 g/L）。综上所述,本文通过强化乙醇代谢途径关键酶AdhE,抑制副产物氢气的生产以及提高细胞乙醇耐受性三种代谢工程改造方式增强了嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacterium aotearoense SCUT27/△ldh）的乙醇生产能力,并初步研究了其对几种木质纤维素的利用能力,为微生物发酵法产乙醇的发展提供了新思路。