一株抗白色假丝酵母菌的解淀粉芽孢杆菌的初步研究

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芽孢杆菌次级代谢产物中的抑菌物质主要是脂肽(lipopeptide)类化合物,主要包括表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)和丰原素(fengycin)3大类,它们通常具有抑制细菌、真菌、病毒以及支原体的作用,对由真菌或病毒引起的疾病的治疗工作具有重要的研究意义。脂肽分子由亲水的肽链和亲油的脂肪烃链两部分组成,正由于它的两亲性结构特点,在食品工业、医药、农业生产等方面都有着广泛的应用价值。本论文从多株有抑制真菌能力的菌株中筛选出抑菌活性最强的anti-CA菌株。通过对该菌株菌落形态鉴定以及16S rDNA序列分析,结果表明该菌株与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)特征相符,并且16S rDNA序列具有高度的同源性,因此鉴定为解淀粉芽孢杆菌。anti-CA菌株能够杀死人类条件致病菌白色假丝酵母菌(Candida albicans)。通过对anti-CA菌株产抗菌活性物质的培养条件优化,确定了该菌株产抗菌活性物质的最佳培养条件为:豆饼粉2.0%(w/v),面粉1.0%(w/v),pH6.5,培养温度28℃,180rpm振荡培养27h。通过2-L发酵罐进行发酵实验,结果表明anti-CA菌株发酵培养21h时进入生长稳定期,菌体量保持在3.3×108个/mL,发酵27h时抗菌活性物质抑菌效果达到最大,经抑菌活性实验检测抑菌圈直径为31.33mm,发酵时间为33h时进入衰亡期。酶活力测定结果显示淀粉酶活力可达110.75U/mL,蛋白酶活力可达到3.82U/mL,为以后anti-CA菌株工业化大规模发酵生产抗菌活性物质奠定了基础。发酵上清液经过酸沉淀、抽提,薄层层析和高效液相色谱法(HPLC)等步骤分离纯化出一种抗菌脂肽。质谱分析表明,此脂肽分子量为1021,分子式为C52H91N7O13。纯化的抗菌脂肽在28℃,pH为7.0的抑菌检测平板上对C. albicans抑菌活力最高。对纯化的anti-CA菌株抗菌脂肽的抑菌机理进行初步探究:纯化的抗菌脂肽不仅可以杀死完整的敏感酵母C. albicans细胞,也可以杀死C. albicans细胞的原生质体。电镜检测发现,被抗菌脂肽处理过的C. albicans细胞的细胞壁表面内陷并且发生皱褶,细胞内基质外泄。荧光染料染色检测发现,经过抗菌脂肽处理后的C. albicans细胞可以被PI染料染成红色,而正常细胞不被染色,这说明了该抗菌脂肽能够破坏敏感酵母菌C. albicans细胞膜的通透性。
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