纳豆激酶(Nattokinase,NK)是一种早在1987年就由日本的Sumi H科学家在纳豆中发现的碱性丝氨酸蛋白酶,而纳豆是由枯草芽孢杆菌发酵而成的,该产品被誉为“超级健康食品”,是21世纪受众人追捧的营养健康食品。该产品在食品及医药领域的价值极为突出。纳豆激酶对缓解心脑血管类病症,降低血粘度,降血压,降血脂,预防骨质疏松及糖尿病,及对木制纤维和皮毛的降纤作用等方面都有非常显著的效果。为此,针对其进行进一步探索研究,对保健类药物及保健食品的开发具有重要意义。但是目前就我们所知,尽管一直以来它的作用功效一直被大众所追捧,但是在表达水平上仍然有待进一步提高,在底物特异性和活性等方向上也需要进一步优化。本研究采用缺失蛋白酶的WB800枯草芽孢杆菌菌株作为表达菌株,进行纳豆激酶的克隆和表达。该菌株能有效的缓解了以往枯草芽孢杆菌菌株表达产物易于被蛋白酶降解的不足。为了实现纳豆激酶基因在枯草芽孢杆菌基因组中的融合表达,本研究还成功的构建了Knock plasmidnew质粒载体,该载体可以同时满足枯草芽孢杆菌中基因敲入和敲除的需要。利用该质粒通过线性化DNA的胞内同源重组,可有效避免以往基因敲入敲除过程中需要反复构建质粒的复杂操作,可以使操作步骤更加简便化。另外,现有的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒只能够在大肠杆菌中进行复制,然后再在枯草芽孢杆菌中进行表达。但是在构建随机突变库进行高通量筛选的过程中,这一穿梭系统显然效率很低。如果能够在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中同时进行表达,则可以显著减少工作量,而且对酶的定向进化和蛋白突变库的筛选尤为重要。因此,本研究中我们致力于双表达质粒载体pSHUTTLE-1-NATTO的构建工作。该质粒具有大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的复制子,并设计了分别能在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中作用的启动子。此外,对质粒中核糖体识别位点(RBS)进行了改造,使得该RBS兼具大肠杆菌和枯草芽孢杆菌RBS的基本特征。基于以上特点,新构建的重组质粒可能实现在两个菌中都能够蛋白表达。同时,本文还针对纳豆激酶进行了生物信息学分析。上述研究,为纳豆激酶的基因的高效表达,分子定向改造和深入研究奠定了基础。此外,我们对现有的枯草芽孢杆菌基因提取方法进行了改进,建立起了一种更加简便,快速,高效的方法。为了检测该方法的使用范围,我们还将该方法应用于菠菜、鱼和其它微生物总DNA的提取,发现该方法同样有效。所提取的DNA具有产量高、品质好、无污染等优点,而且提取速度和简便程度显著优于以往的其它方法。据了解,目前还没有植物、动物和微生物细胞DNA提取的通用方法,因此本方法的建立不仅为本研究奠定了基础,也为相关研究提供了有益的参考。