肾素-血管紧张素系统（RAS）对维持心血管系统正常生理功能发挥重要作用,但该系统功能的失调参与高血压、心力衰竭、动脉粥样硬化等许多心血管疾病的发生,具有重要的病理生理意义。近年,大量的临床报道表明,减少血管紧张素Ⅱ产生的血管紧张素Ⅰ转化酶抑制剂（angiotensin-converting enzyme inhibitors,ACEI）和AngⅡ的Ⅰ型受体AT₁受体拮抗剂可明显降低心衰病人心律失常所致的心性猝死（Sudden cardiac death, SCD）危险性,成为目前临床治疗高血压、心衰的重要药物。然而,RAS潜在致心律失常的机制尚不清楚。选择性心肌组织过表达AngⅡ基因或AT1受体的小鼠出现明显复极化延迟,伴高发的室性心律失常,年幼的转基因动物在不存在组织肥厚性重构情况下就伴高发的心律失常,提示AngⅡ可能通过直接调控心肌离子通道参与病理情况下心律失常的产生。但目前AngⅡ对心肌电生理活动的直接调控作用了解极少,我们的总体目标是研究AngⅡ对心肌细胞电活动的直接影响,以揭示病理情况下心律失常的产生机制。在前期的研究中我们业已发现,AngⅡ可以抑制豚鼠心室肌细胞的快激活延迟整流钾电流（Ikr）、延迟动作电位复极过程。窦房结是心脏自律性发源地,其起搏功能对维持心脏正常的泵血功能至关重要。慢性心衰病人常常伴有明显窦房结电生理重构,导致其储备功能降低,有资料显示,由此形成的缓慢型心律失常造成的SCD可高达住院病人SCD的42%。因此,了解窦房结自律性产生机制及其调节具有重要意义。半个世纪以来普遍认为心脏节律开始于窦房结起搏细胞膜表面各种电压依赖的离子通道,起搏细胞动作电位的产生正是这些离子通道共同作用的结果。由于膜离子通道的开放与关闭受膜电位的影响,因此该过程又称为膜钟（membrane clocks）。近年有人提出,细胞内Ca²⁺释放是窦房结自律性产生的另外一个机制,即在窦房结起搏细胞中,细胞内Ca²⁺([Ca²⁺]_in)的循环诱导了membrane clocks的发生,构成了自动去极化的重要起因,人们将这一机制称为钙钟(Ca²⁺ clock)。迄今为止,关于AngⅡ对窦房结细胞自律性及其对上述膜钟、钙钟的影响报道较少且不一致。KCNA5基因编码的Kv1.5通道蛋白构成了心房细胞超速激活的外向整流钾电流(I_kur)通道,为心房细胞特有的钾通道,在心房细胞动作电位复极过程中发挥重要作用。目前关于AngⅡ对Kv1.5通道的直接调控作用尚不清楚。本实验利用全细胞膜片钳电生理记录技术,在急性分离的豚鼠窦房结细胞观察了AngⅡ对窦房结自发起搏频率的影响,并分析了对膜钟、钙钟的调控;在表达Kv1.5的人胚胎肾细胞（HEK₂93）上,观察AngⅡ对hKv1.5的直接调控作用,并初步分析其作用机制。以其为全面了解AngⅡ的心肌电生理效应提供试验依据。第一部分AngⅡ对豚鼠窦房结细胞的电生理影响目的:观察AngⅡ对豚鼠窦房结细胞自发起搏频率及膜离子通道电流的影响方法:在急性分离的豚鼠窦房结细胞,常规全细胞膜片钳技术记录并观察AngⅡ对窦房结动作电位（AP）、超极化激活起搏电流I_f、延迟整流钾电流慢成份I_ks及L型钙电流I_CaL影响。用于窦房结细胞自发动作电位记录的细胞外液组成（in mM）:NaCl 138, KCl 4, MgCl₂ 1, CaCl₂ 2, NaH₂PO₄ 0.33, glucose 10,和HEPES 10 （用NaOH调pH至7.4）.;电极内液成分包括（in mM）: KCl 140, MgCl₂ 5, K₂ATP 1,和HEPES 3 （用KOH调pH至7.2）,电极内液中加入两性霉素B （240μg/ml）。记录I_f的细胞外液为（in mM）:NaCl 132, KCl 4, MgCl₂ 1.2, CaCl₂ 1.8, glucose 5, and HEPES, 10 （用NaOH调pH至7.4）;电极内液成份为（in mM） :KCl 150, K₂ATP 1, MgCl₂ 5,和HEPES 3 （用KOH调pH至7.2）。电极内液中加入两性霉素B （240μg/ml）。将窦房结细胞钳制在-40 mV,从-50 mV开始以阶跃电压-10 mV的方式逐步超极化至-110 mV,持续3s,然后复极至- 40 mV,记录到I_f电流。该电流可以被2 mM CsCl完全阻断。记录I_ks的细胞外液（in mM） :NaCl, 132; KCl, 4; CaCl₂, 1.8; MgCl₂, 1.2; glucose, 5和HEPES 10 （用NaOH调pH至7.4）;加Nimodipine （1μM）加到外液中用于阻断I_CaL、加入2μM E-4031阻断I_kr。。电极内液（in mM） :potassium asparate 70, KCl 50, KH₂PO₄ 10, Na₂ATP 3, LiGTP 0.1, EGTA, 5和HEPES 5 （用KOH调pH至7.2）。将细胞钳制在-50 mV,从-40 mV以阶跃电压10 mV的方式去极化至+50 mV,维持2s,然后复极至-40 mV,诱发I_ks外向尾电流。记录I_CaL的细胞外液（in mM）:NaCl 135, CsCl 10, MgCl₂ 1, CaCl₂ 1.8, glucose, 10, HEPES 5和tetrodotoxin 0.003 （用NaOH调pH至7.4）.;电极内液（in mM）:aspartic acid 90, NaCl 10, CsOH 100, CsCl 30, MgCl₂ 2, EGTA 5, CaCl₂ 2, HEPES 10, ATPNa₂ 2和GTPNa₂ 0.1 （用KOH调pH至7.2）。将细胞钳制在-50 mV,从-40 mV以阶跃电压10 mV的方式去极化至+50 mV,维持300 ms,然后复极至-40 mV,诱发内向I_CaL电流。以上实验均在36±1℃条件下进行。结果:灌流外液中加入AngⅡ后可明显降低窦房结细胞的自动起搏频率,抑制作用在第3 min出现,10 min左右达到稳态,冲洗后抑制作用不能完全恢复,AngⅡ（100 nM）使自发起搏频率和舒张期去极化频率分别从171±5 beats /min和150±5 mV/s降至113±8 beat/min（P<0.05）和70±6 mV/s （P<0.01）。以自发起搏频率抑制率为纵座标做出AngⅡ作用的量效曲线,经Hill方程拟合后得到IC₅₀为8.34 nM。AT₁受体阻断剂valsartan（1μM）拮抗AngⅡ对自发起搏频率的抑制作用,而AT₂受体阻断剂PD123319 （1μM ）并不影响AngⅡ的作用。AngⅡ并不明显影响I_f电流幅值,但可显著增大I_ks去极化外向电流及复极时的尾电流,当去极电压为+50 mV时,尾电流由给药前的7.0±0.5 pA/pF增大到9.0±0.5 pA/pF（n=6, P <0.01）,分析通道动力学发现,AngⅡ可显著增大去活时间常数。此外,AngⅡ可显著抑制I_CaL电流,当去极电压为+10 mV时,AngⅡ（100 nM）使I_CaL电流密度峰值由给药前的11.3±1.6 pA/pF降低到7.5±1.0 pA/pF （n=6, P<0.05）。小结:AngⅡ通过增大I_ks、抑制I_CaL降低豚鼠窦房结起搏频率,这种抑制作用由AT₁受体介导。第二部分钙钟机制在AngⅡ减慢窦房结自律性中的作用目的:观察AngⅡ是否通过影响窦房结细胞内Ca²⁺调控自发起搏频率。方法:（1）在急性分离的豚鼠窦房结细胞上,利用共聚焦显微镜观察AngⅡ（100 nM）对细胞内Ca²⁺的影响。分离窦房结细胞后,4℃静置1小时后,用钙荧光探针flu-3AM （1μM）孵育细胞20分钟后,将细胞置于36±1℃恒温灌流槽中,记录给药前后钙荧光强度的变化。（2）用全细胞膜片钳技术记录窦房结自发动作电位,观察细胞内Ca²⁺被BAPTA螯合或Ryanodine抑制Ca²⁺释放对AngⅡ抑制自发起搏频率作用的影响。结果:（1）首先用激光共聚焦显微镜观察阳性对照药异丙肾上腺素（ISO）对细胞内钙的影响。与给药前（Control）比较, 1μM ISO可显著性增大细胞内Ca²⁺51%（荧光强度102.2±4.71 vs. 154.5±4.13, P<0.01, n=5 ）;与Control比较,100 nM AngⅡ可显著性增大细胞内Ca²⁺37% （荧光强度111±2.53 vs. 152.4±4.22, P<0.01, n=5 ）。（2）利用全细胞膜片钳技术记录窦房结细胞自发动作电位,通过吸破细胞膜,使电极内液中20 mM BAPTA进入细胞胞浆。随着BAPTA在胞浆中透析,自发动作电位频率逐渐减慢,在吸破细胞膜第60s,自发动作电位完全消失。电极内液中加入1 mM BAPTA,破膜后自发动作电位频率减慢,4分钟后趋向稳定,由176±10次/分钟下降至86.2±5次/分钟（减少51%）（P<0.01, n=6）,在此基础加入100 nM AngⅡ,细胞自发起搏频率进一步下降至38.72±4次/分钟（与给药前比较减少78%）,与不加BAPTA情况相比,100 nM AngⅡ抑制作用显著性增强。电极内液应用2μM Ryanodine,窦房结起搏频率显著性降低（P<0.01, n=6）,从182±12次/分钟减少至91±6次/分钟,约减慢50%,10 min后,再应用100 nM AngⅡ,AngⅡ对起搏频率不再进一步抑制。改用低浓度Ryanodine（100 nM）,自发起搏频率由180±5次/分钟降低至122.4±7次/分钟,下降32%（P<0.01, n=6）,10min后,作用稳定,再应用100 nM AngⅡ,自发起搏频率由122.4±7次/分钟降低至100.8±6次/分钟,与不存在Ryanodine情况相比,100 nM AngⅡ抑制作用显著性增强。（3）电极外液应用非特异性PLC抑制剂U-73122 （100 nM） 10分钟可完全取消AngⅡ对自发起搏频率的抑制作用。小结:AngⅡ可增加细胞内Ca²⁺浓度,螯合细胞内Ca²⁺或抑制Ca²⁺释放可增强AngⅡ的作用,提示膜钟和钙钟机制共同影响了AngⅡ对窦房结细胞起搏频率的抑制作用,对膜钟的调控降低细胞自律性,而对钙钟的调控可增加细胞自律性,其中以对膜钟的调控作用占主导地位。AngⅡ对膜钟和钙钟的调控均通过激活PLC实现。第三部分AngⅡ对表达Kv1.5通道的影响目的:分析AngⅡ对异源表达的Kv1.5通道电流影响及其分子机制方法:采用脂质体瞬时转染方法,HEK₂93细胞共转染人Kv1.5 cDNA及人AT1受体基因,观察AngⅡ对通道电流的影响。记录hKv1.5的细胞外液包括（in mM） NaCl 140, KCl 5.4, MgCl₂ 1, CaCl₂ 2, glucose 10,HEPES 10 （用NaOH调pH至7.4）.电极内液包括（in mM） KCl 140, Mg-ATP 4, MgCl₂ 1, EGTA 5,HEPES 10（用KOH调pH至7.2）.将细胞钳制在-70 mV,从-60 mV以阶跃电压10 mV的方式去极化至+80 mV,维持100 ms,然后电压复极至+40 mV,诱发外向尾电流。细胞钳制在-100 mV,短暂去极至40 mV,然后超极化至-100 mV,持续2 s,然后从-70 mV开始以阶跃电压10 mV的方式逐步去极化至30 mV,维持5 s,然后细胞最终去极至40 mV并持续1s。以在40 mV的最大电流进行标化,用Boltzmann方程拟合得到失活曲线,结果:AngⅡ（100 nM）可著性抑制hKv 1.5电流,应用AngⅡ后,第3分钟左右尾电流幅值减小,20分钟左右抑制作用达到稳态,冲洗后不能恢复。在去极电压为80 mV下,AngⅡ使尾电流由18.22±0.4pA/pF减小3.06±0.5pA/pF（P<0.01,n=6）。以最大尾电流电流密度标准化后用Boltzmann方程拟合得到激活曲线, AngⅡ对Kv1.5通道的半数激活电压没有影响。AngⅡ显著性减小hKv1.5通道的激活、去激活时间常数（P<0.01,n=6）。应用hKv1.5特异性阻断剂E-4031（2μM）可完全阻断复极时的外向尾电流。细胞钳制在-100 mV,短暂去极至40 mV,随后超极化至-100 mV,持续2s,然后从-70 mV开始以阶跃电压10 mV的方式逐步去极化至30 mV,维持5 s,然后细胞最终去极至40 mV并持续1 s。以40 mV的最大电流进行标化,用Boltzmann方程拟合得到失活曲线,V_1/2由-20±1.94 mV变为-19.4±4.33 mV,无显著性差异。表明AngⅡ对Kv1.5通道的稳态失活无明显影响。PKC抑制剂staurosporin （Stau） （100 nM）存在下,AngⅡ（100 nM）对hKv1.5的抑制由对照的85.0%减少到11.8% ,提示PKC通路介导AngⅡ对hKv1.5的抑制作用。小结:AngⅡ激动AT₁受体对Kv1.5电流产生抑制作用,这种抑制作用主要由PKC通路介导。结论:1 AngⅡ通过增大I_ks抑制I_CaL降低豚鼠窦房结起搏频率,这种抑制作用由AT₁受体介导。2膜钟和钙钟机制共同影响了AngⅡ对窦房结细胞起搏频率的抑制作用,其中以膜钟的调控作用占主导地位。3 AngⅡ激动AT₁受体对Kv1.5电流产生抑制作用,这种抑制作用主要由PKC通路介导。本实验结果提示,AngⅡ通过激动AT₁受体对窦房结细胞及心房hKv1.5通道具有直接的电生理调控作用,为病理状态下心脏AngⅡ水平升高引发电生理重构、从而易发心律失常提供了一个可能的解释。