牙髓间充质细胞(Dental Mesenchymal cells)是牙髓组织中具有多向分化能力的细胞,可应对许多损伤反应,如迁移至龋病损伤区域,形成修复性牙本质抵御外界刺激。因此,任何干扰人牙髓间充质细胞细胞活性的临床操作都可能引起牙髓组织内稳态的严重改变。复合树脂材料因其具有美观、简易操作及安全性能等,近来成为牙科充填治疗和粘结修复的主要生物材料。二甲基丙烯酸羟乙酯(2-Hydroxyethyl methacrylate,HEMA)是复合树脂材料基质中主要的单体成分,是一种中性亲水单体。HEMA具有其亲水性和低分子量等特征,通过与水竞争,浸润、渗透入牙本质有机基质网中,促进树脂流动和分散,有效增强树脂与牙本质的结合强度。其特性同时也使HEMA在牙科治疗过程中,易于从未聚合完全的树脂中游离出来,通过牙本质小管扩散至口腔组织中,引起组织细胞毒性反应。然而,HEMA对牙髓间充质细胞的毒性作用机制仍未被阐明。细胞自噬(Autophagy)是一种高度保守的细胞代谢程序,通过将细胞内成分输送至溶酶体进行降解来控制蛋白的质量。在正常生理条件下,自噬对维持细胞内环境稳态均发挥重要调节作用。在应激或病理条件下,细胞自噬可以被大量激活,消化降解细胞内多余的蛋白以及功能受损伤的细胞器,达到维持细胞内环境稳定的作用。近来自噬被发现在口腔疾病领域发挥重要作用,包括参与单体诱发的细胞毒性。而HEMA单体对牙髓间充质细胞内自噬水平的作用尚无研究。细胞凋亡(Apoptosis),即Ⅰ型细胞程序性死亡,是一种调节细胞死亡的重要机制,可激活特殊酶蛋白-半胱天冬酶。半胱天冬酶是迅速分解转移细胞器和其他细胞结构的主要蛋白酶。细胞凋亡参与许多细胞损伤和应激,也参与机体的生长发育和分化过程。当机体受疾病或有害物质危害时,细胞凋亡发挥防御机制,如免疫反应等。细胞自噬和细胞凋亡是生物学上紧密关联的两种过程,在不同的环境下二者之间的关系也不同。核因子κB(NF-κB)属于转录因子家族,在许多信号转导途径中起着关键作用。它可能通过调控不同的靶点而发挥抗凋亡或者亲和凋亡的转录因子的作用。NF-κB也调节参与自噬,在不同环境条件下促进或抑制自噬发生。HEMA单体诱发多种类型细胞的毒性机制与凋亡的发生有关,且NF-κ B信号通路参与HEMA引起的细胞毒性过程。而自噬在HEMA处理的牙髓间充质细胞中的作用尚无研究,且自噬对HEMA诱导的细胞凋亡的作用也尚未明确。故本课题旨在研究HEMA是否影响牙髓间充质细胞内自噬水平,并进一步探讨自噬对HEMA诱导的细胞凋亡的作用和机制。研究一 HEMA诱导人牙源性间充质细胞发生凋亡的体外研究目的:明确HEMA的物理化学性质,研究HEMA对人牙髓间充质细胞的增殖、凋亡及活性氧水平等生物学行为的影响。方法:通过衰减全反射率傅立叶红外光谱(ATR-FTIR)和显微拉曼光谱(LabRAM,HoribaJobinYvon,France)确定树脂单体HEMA的理化性质。收集健康年轻前磨牙和第三磨牙,获取牙髓间充质细胞。用完全细胞培养基将HEMA稀释成不同浓度(0,1,2,4,6,8,10mM)后,对人牙髓间充质细胞进行培养不同时间(12,24,48,96h)。使用Cell counting kit-8(CCK-8)试剂盒检测牙髓间充质细胞的活性和增殖情况,Annexin V-PI双染后流式细胞术检测牙髓间充质细胞凋亡情况,Hochest荧光染色观察牙髓间充质细胞核变化。DCF-DA染色-流式细胞术检测细胞内活性氧聚集。Hochest荧光染色检测细胞核改变。结果:HEMA以浓度依赖和时间依赖的方式降低牙髓间充质细胞活力。8mM HEMA处理48小时组可观察到明显的细胞活力下降(约60%)。早期细胞凋亡率和晚期细胞凋亡率与HEMA处理浓度和处理时间呈正相关。8mM HEMA处理48小时组细胞凋亡率达近40%。HEMA以浓度依赖方式诱导细胞内活性氧聚集。HEMA处理组细胞核呈现凋亡特征改变。结论:HEMA对牙髓间充质细胞活力的抑制和对细胞凋亡率的促进呈浓度依赖和时间依赖;HEMA以时间依赖方式促进细胞内活性氧水平增加。研究二HEMA通过自噬途径诱导人牙髓间充质细胞发生凋亡的体外研究目的:探究HEMA对牙髓间充质细胞自噬水平的影响,明确细胞自噬在HEMA诱导的牙髓间充质细胞凋亡中的作用,以及激活自噬的相关机制。方法:吖啶橙(AO)和单丹磺腺尸胺(MDC)染色探究细胞内酸性泡和自噬泡的形成水平;实时荧光定量PCR分析自噬相关mRNA(Beclin 1和LC3)的表达水平;细胞免疫荧光染色检测细胞内自噬相关蛋白(Beclin 1、Atg5和LC3)的表达水平;Western blot检测牙髓间充质细胞内自噬相关蛋白(ULK1、Beclin 1、Atg5和LC3)的表达水平;透射电镜观察细胞质超微结构内自噬体的形态和结构。细胞自噬抑制剂(氯喹,CQ和3-甲基腺嘌呤,3-MA)和NF-κB抑制剂BAY 11-7082[(E)-3-(对甲苯磺酰基)]预处理牙髓间充质细胞,以抑制细胞自噬水平,检测自噬和凋亡相关mRNA和蛋白的表达情况。结果:HEMA促进牙髓间充质细胞内橙红色吖啶橙染的酸性泡数量增加,诱导细胞内MDC染的亮绿色自噬泡的数目显著增加。细胞经HEMA处理后,Beclin 1和LC3 mRNA表达水平显著增加。免疫荧光和Western blot结果显示HEMA诱导细胞内Beclin 1、Atg5和LC3蛋白水平显著提高。透射电镜结果提示HEMA促进细胞内自噬体和溶酶体数量增加。细胞自噬抑制剂CQ和3-MA可逆转HEMA诱导的自噬水平,降低Beclin 1、Atg5和LC3的表达。CQ和3-MA也可逆转HEMA诱导的细胞凋亡水平,明显降低早期凋亡和晚期凋亡的细胞数量。HEMA可诱导NF-κ B p65的核转录和磷酸化,且NF-κ B信号通路抑制剂BAY 11-7082可明显阻滞细胞内自噬水平。NF-κB信号通路抑制剂BAY 11-7082也可显著抑制HEMA诱导的细胞凋亡水平。结论:HEMA通过NF-κ B-自噬轴诱导牙髓间充质细胞内细胞凋亡发生研究三HEMA对离体人牙髓组织中细胞自噬和凋亡水平的作用及机制研究目的:通过离体培养人牙髓组织器官,模拟体内环境,探索HEMA对牙髓组织的毒性作用,以及其对牙髓组织中自噬水平和NF-κ B信号通路的表达情况的影响。方法:获得新鲜离体人牙体组织进行组织切片器官培养。8 mM HEMA处理牙切片不同时间(12,24,48h)后,对牙切片进行CCK-8实验,检测牙髓组织中细胞的活力。苏木素-伊红染色检测牙髓组织的形态特征和细胞分布。透射电镜观察牙髓组织内超微结构和细胞的形态,包括自噬体的数量和细胞核的变化。组织免疫荧光染色检测HEMA处理后的牙髓组织内Beclin 1和NF-κ B p65的表达情况。结果:HEMA明显抑制牙髓组织内细胞活力,呈时间依赖性。苏木素-伊红染色显示HEMA处理组牙髓组织内细胞数量明显减少,且细胞核浓缩深染。透射电镜显示HEMA处理组牙髓组织内细胞核呈凋亡性改变,且自噬体和溶酶体数量显著增加。组织免疫荧光证实HEMA可促进牙髓组织细胞内自噬相关蛋白Beclin 1的表达增加,且NF-κB p65的胞质表达和核转录也明显增加。结论:HEMA抑制牙髓组织内细胞活力,激活细胞内NF-κB信号通路,同时促进细胞自噬和凋亡水平的增加。