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目的:双特异性抗体近年来成为肿瘤治疗的新方法,其可通过介导T细胞靶向杀伤肿瘤细胞。肝癌的复发和转移通常与肿瘤起始细胞有关,本实验室之前发现α2δ1（isoform 5）是肝癌的一个肿瘤起始细胞标志物,靶向该抗原的1B50-1可以通过消除肿瘤起始细胞从而减缓肝癌的生长。本研究旨在构建抗α2δ1和CD3的双特异性抗体,并在体内外评价其杀伤肝癌干细胞的功能。方法:通过基因工程技术,构建稳定表达T细胞衔接子（bispecific T-cell engager,Bi TE）和双可变域免疫球蛋白（dual-variable-domain immunoglobulin,DVD-Ig）形式的抗α2δ1和CD3的双特异性抗体的真核表达质粒,转染Expi 293F细胞后,1B50-1-g OKT3-7 Bi TE和1B50-1-V9 Bi TE选取转染4天后的细胞上清使用镍离子亲和色谱纯化,1B50-1-g OKT3-7 DVD-Ig G1选取转染6天后的细胞上清使用Protein G亲和色谱纯化。在得到纯化的抗α2δ1和CD3的双特异性抗体后,将纯化的抗体通过SDS-PAGE蛋白电泳和考马斯亮蓝染色鉴定抗体和检测抗体的纯度,通过Superdex 200检测抗体的聚集程度,通过流式细胞术检测1B50-1-g OKT3-7 DVD-Ig G1对α2δ1和CD3的结合性质,使用Perkin Elmer Operetta高内涵成像仪测定1B50-1-g OKT3-7 DVD-Ig G1介导细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes,CTLs）对高表达α2δ1的人肝癌细胞Hep-12的杀伤效应,使用ELISA法检测杀伤过程中CTLs分泌TNF-α和IFNγ的变化,通过Hep-12细胞/外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）共移植模型中检测1B50-1-g OKT3-7 DVD-Ig G1抑制Hep-12细胞的体内成瘤能力。结果:成功构建出分别稳定表达1B50-1-g OKT3-7 Bi TE、1B50-1-V9 Bi TE和1B50-1-g OKT3-7 DVD-Ig G1的真核表达质粒,转染后纯化出的1B50-1-g OKT3-7 Bi TE、1B50-1-V9Bi TE和1B50-1-g OKT3-7 DVD-Ig G1的蛋白分子量符合理论分子量,且蛋白纯度较高。1B50-1-g OKT3-7 Bi TE的纯化量为0.5-0.7mg/L,1B50-1-V9 Bi TE的纯化量为6-7 mg/L,1B50-1-g OKT3-7DVD-Ig G1纯化量为2-3 mg/L。1B50-1-V9 Bi TE中多聚的蛋白较多,不符合预期,1B50-1-g OKT3-7 DVD-Ig G1中单体的蛋白占大多数,且出峰位置符合预期,所以1B50-1-g OKT3-7 DVD-Ig G1的表达量和蛋白性质比较符合用于治疗的抗体要求,在后续的实验中选取1B50-1-g OKT3-7 DVD-Ig G1。1B50-1-g OKT3-7 DVD-Ig G1可以特异性结合α2δ1和CD3,在体外试验中,1B50-1-g OKT3-7DVD-Ig G1可以有效介导CTLs靶向杀伤高表达α2δ1的人肝癌细胞Hep-12,其介导杀伤Hep-12细胞的EC50为1.9 pmol/L,对于低表达α2δ1的人肝癌细胞Hep-11,1B50-1-g OKT3-7 DVD-Ig G1不能介导CTLs发挥杀伤作用,并且在杀伤过程中Hep-12细胞组CTLs释放的TNF-α和IFNγ比Hep-11细胞组显著增多（P<0.05）,体内试验中,1B50-1-g OKT3-7 DVD-Ig G1可以有效抑制Hep-12细胞体内成瘤。结论:1B50-1-g OKT3-7 DVD-Ig G1能有效介导T细胞特异杀伤高表达α2δ1的人肝癌细胞Hep-12,为肝癌的免疫治疗提供了希望。