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结核分枝杆菌(Mycobacterium tubercuLosis,Mtb)是引起人和动物结核病的病原体。巨噬细胞作为Mtb的主要靶细胞和免疫细胞,在抗Mtb感染中发挥着重要作用。研究表明,巨噬细胞可通过自噬途径有效清除Mtb,而Mtb也可通过某些机制逃避自噬的清除作用。酯酰辅酶 A 胆固醇酰基转移酶(Acyl Coenzyme ACholesterol Acyltransferases,ACAT)蛋白家族在体内胆固醇吸收与代谢平衡中发挥着重要作用。ACAT1是游离胆固醇酯化的关键酶,广泛存在于动物组织和细胞中。ACAT1的高表达可影响胞内胆固醇代谢平衡并促进巨噬细胞泡沫化,也可对细胞自噬水平产生影响。为了探究ACAT1对Mtb诱导巨噬细胞自噬的调控作用及其机制,本研究在BCG感染巨噬细胞的基础上,分别采用ACAT1抑制剂阿伐麦布(Avasimibe)、mTOR抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)处理 RAW264.7 细胞、牛肺泡巨噬细胞(Bovine alveolar macrophages,BAMs)及在RAW264.7细胞中过表达/干扰ACAT1后,检测ACAT1蛋白、自噬相关蛋白、PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达及胞内胆固醇水平的变化。实验结果如下:1.BCG感染BAM和RAW264.7细胞2h、6h、12h、24h后,随感染时间的延长,ACAT1蛋白表达量、胞内胆固醇酯含量和胞内脂滴先下降后上升,RAW264.7细胞中12h最低,而BAMs中6h最低,而胞内游离胆固醇含量与之相反。随BCG感染时间的延长,自噬相关蛋白Beclin1和LCⅡ/Ⅰ的表达量先上升后下降,RAW264.7细胞中12h最高,而BAMs中6h最高。结果提示,BCG感染巨噬细胞后,ACAT1可通过改变胞内胆固醇水平影响细胞自噬水平。2.采用慢病毒转染,并经RT-PCR及Western blot方法验证,成功获得了 ACAT1过表达/干扰的RAW264.7稳定转染细胞株,为后续探究ACAT1在BCG诱导巨噬细胞自噬中的调控作用提供了实验材料。3.用Avasimibe处理RAW264.7细胞和BAMs,并经BCG感染12h后,自噬相关蛋白Beclin1、Atg5、Atg7和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达量显著升高。结果表明,抑制ACAT1可促进BCG诱导的巨噬细胞自噬。4.BCG感染ACAT1过表达的RAW264.7稳定转染细胞株12h后,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg5和Atg7的表达量显著降低,同时胞内游离胆固醇含量亦显著降低,胆固醇酯含量显著升高;BCG感染ACAT1干扰的RAW264.7稳定转染细胞株12h后,自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg5和Atg7表达量显著升高,同时胞内游离胆固醇含量亦显著升高,胆固醇酯含量显著降低。结果证实,BCG感染巨噬细胞后,ACAT1可通过降低胞内胆固醇酯含量从而促进细胞自噬。5.采用Rapamycin处理RAW264.7细胞和BAMs,并经BCG感染12h后,ACAT1蛋白表达下调。结果表明,PI3K/mTOR信号通路通过影响ACAT1表达进而调控BCG诱导的巨噬细胞自噬水平。6.干扰或抑制ACAT1,并经BCG感染巨噬细胞12h后,PI3K/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、mTOR、P-mTOR和P-Akt蛋白的表达显著下调;而过表达ACAT1并经BCG感染巨噬细胞12h后,PI3K/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、mTOR和P-mTOR蛋白的表达显著上调。结果表明,BCG感染巨噬细胞后,ACAT1对PI3K/mTOR信号通路介导的自噬具有调控作用。上述结果显示,在BCG感染巨噬细胞后,ACAT1通过影响胞内胆固醇水平,并与PI3K/Akt/mTOR信号通路协同作用发挥对巨噬细胞自噬的调控作用。