【摘 要】
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目的:通过生信分析、收集分离脓毒症患者外周血单核细胞,利用THP-1细胞构建脓毒症细胞模型,探究NEDD4L、MEKK2表达与脓毒症炎症因子释放的关系,为NEDD4L作为脓毒症治疗靶点提供依据。方法:1.通过GEO数据库的GSE28750数据集,运用R语言生信分析工具sangerbox,获取其数据库中10位脓毒症患者以及20位健康患者外周血样本所有基因表达信息。使用sangerbox3.0筛选差异
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目的:通过生信分析、收集分离脓毒症患者外周血单核细胞,利用THP-1细胞构建脓毒症细胞模型,探究NEDD4L、MEKK2表达与脓毒症炎症因子释放的关系,为NEDD4L作为脓毒症治疗靶点提供依据。方法:1.通过GEO数据库的GSE28750数据集,运用R语言生信分析工具sangerbox,获取其数据库中10位脓毒症患者以及20位健康患者外周血样本所有基因表达信息。使用sangerbox3.0筛选差异基因,KEGG富集分析差异基因的相关信号通路。2.收集南昌大学第一附属医院EICU脓毒症患者20例以及健康体检者10例外周血5ML,分成正常对照和实验组,使用淋巴分离液采用密度离心法分离出单核核细胞,q-PCR检测IL-6、TNF-α、NEDD4L及MEKK2的m RNA的表达,通过spearman相关分析分析NEDD4L、MEKK2与炎症因子之间的相关性。3.取人白血病单核细胞（THP-1）,接种与T25培养瓶,当细胞生长到一定量时用不同浓度的LPS刺激,构建体外细胞模型。分组（1）对照组:不做任何处理;（2）实验组:LPS浓度50ng刺激。使用q-PCR等实验方法检测6H、12H、24H的NEDD4L、MEKK2、IL-6、TNF-α的m RNA的表达。4.合成特异性干扰RNA（si-NEDD4L）,下调NEDD4L在脓毒症模型中的表达,探究NEDD4L是否参与THP-1细胞炎症释放。将已经沉默NEDD4L的THP-1细胞加入50ng/ml的LPS刺激12H。q-PCR检测:IL-6、TNF-α的表达。5.利用ALCAP2上调NEDD4L。q-PCR、Western Blot检测NEDD4L、MEKK2的表达。转染si-NEDD4L于THP-1细胞中沉默NEDD4L。使用50ng/ml的LPS刺激THP-1细胞。q-PCR检测0H、6H、12H时NEDD4L、MEKK2的m RNA的表达。6.使用S20、S26蛋白酶体抑制剂处理脓毒症细胞模型,抑制泛素降解途径,Western Blot检测MEKK2蛋白的表达。结果:1.通过sangerbox3.0筛选出多个与脓毒症相关基因,NEDD4l符合差异基因的标准,在脓毒症的作用值得进一步研究。通过GO和KEGG富集分析发现,脓毒症的发病与MAPK信号通路及多条炎症及免疫通路相关。2.与健康人相比,脓毒症患者单核细胞IL-6、TNF-α、NEDD4L、MEKK2的m RNA的表达水平均升高（P＜0.05）脓毒症患者中NEDD4L的m RNA的表达与MEKK2表达成负相关,NEDD4L与IL-6、TNF-α成负相关。3.脓毒症细胞模型中,与对照组相比,LPS刺激的THP-1细胞中IL-6、TNF-α、NEDD4L、MEKK2的m RNA的表达水平均升高（P＜0.05）,随着刺激时间延长NEDD4L表达下降,MEKK2表达上升,IL-6、TNF-α表达升高。4.使用si-NEDD4L下调NEDD4L的表达,与对照组相比,LPS+SiNEDD4L组中IL-6、TNF-α的m RNA的表达明显升高,有显著差异（P＜0.05）,表明NEDD4L可能参与THP-1细胞炎症因子的释放。5.使用ALCAP2上调NEDD4L,与对照组相比,MEKK2表达下降,IL-6、TNF-α下降,有显著差异（P＜0.05）。转入干扰RNA,下调NEDD4L的表达,MEKK2表达上升,IL-6、TNF-α表达升高,有显著差异（P＜0.05）。表明NEDD4L可能通过调节MEKK2影响炎症因子的释放。6.使用S20、S26蛋白酶体抑制剂处理脓毒症细胞模型,抑制泛素化降解途径。与刺激组相比,未用MG132刺激组,MEKK2下降,表明NEDD4L可能通过泛素蛋白酶体系统调节MEKK2。结论:1.在生物信息学分析中,NEDD4L是脓毒症差异基因,与脓毒症发病机制的多条炎症通路有关,其中与MAPK信号传导通路最为密切。2.脓毒症中NEDD4L可能通过泛素化调节MEKK2影响单核细胞IL-6、TNF-α等炎症因子的释放。
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