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目的:本研究利用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography,HPLC）和液质联用（UHPLC-QE-MS）技术对甘草附子汤水提物中的化学成分进行了定性与定量分析;通过碘乙酸钠（Sodium Iodoacetate,MIA）膝关节腔注射复制大鼠骨关节炎模型,甘草附子汤灌胃给药,探讨甘草附子汤对骨关节炎大鼠的防治作用及机制;MIA作用于原代软骨细胞造成损伤模型,利用甘草附子汤含药血清进行干预,考察甘草附子汤对软骨细胞的保护作用及机制。方法:1.通过HPLC和UHPLC-QE-MS技术对甘草附子汤水提物中化学成分进行定性和定量检测分析。2.采用关节腔内注射MIA法复制大鼠骨关节炎模型。造模后,正常组、模型组灌服生理盐水,阳性组灌服硫酸氨基葡萄糖,甘草附子汤低、中、高剂量组分别按生药量3 g·kg-1、6 g·kg-1、12 g·kg-1灌服,所有动物连续给药30d。给药期间,每周进行一次动物行为学检测;取材后,应用ELISA试剂盒检测关节灌洗液和血清用中相关生化指标含量;苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin Staining,HE）染色观察关节病理状态;蛋白免疫印迹法（Western Blot,WB）法检测软骨组织中相关蛋白表达。3.提取软骨组织蛋白,应用Nano-LC-LTQ-Orbitrap系统检测关节软骨蛋白,Protein Discovery软件进行蛋白质鉴定,SIEVE软件对蛋白进行相对定量分析,PANTHER Classification System数据库对差异蛋白进行String分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集信号通路。4.采用中药血清药理学方法,制备甘草附子汤含药血清。提取大鼠胎鼠原代软骨细胞,MIA刺激2h后,甘草附子汤含药血清培养48h,主要通过检查以下指标:Cell Counting Kit-8（CCK-8）法检测软骨细胞的增殖;ELISA试剂盒检测培养基上清中相关生化指标的含量;WB法检测软骨细胞中相关蛋白的表达;FITC-Annexin V/PI荧光双染观察软骨细胞凋亡情况;免疫细胞化学（Immunocytochemistry,ICC）法观察软骨细胞基质金属蛋白酶-3（Matrixmetalloproteinase-3,MMP-3）的表达。考察甘草附子汤含药血清对软骨细胞的保护作用,并利用阻断剂LY294002阻断软骨细胞PI3K通路,初步探究甘草附子汤对软骨细胞的保护机制。结果:1.通过检测和数据分析,甘草附子汤水煎剂中分析出489个化合物,其中包括黄酮类104个、苯丙素类55个、萜类107个、香豆素及其衍生物7个、生物碱45个、酚类38个、其他类133个。2.实验结果显示,MIA造模后,大鼠的疼痛指数和关节宽度显著上调;关节灌洗液中的肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）,白细胞介素-1β（Interleukin-IL-1β,IL-1β）,基质金属蛋白酶-3（Matrix metalloproteinase-3,MMP-3）含量显著升高,基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（Tissue inhibitors of matrix metalloproteinases,TIMP-1）含量显著降低;大鼠关节面粗糙破损,软骨层变薄,滑膜增生厚薄不均,关节腔间隙变大,软骨细胞排列紊乱;软骨组织中的Bax和MMP-3蛋白表达上调,Bcl2蛋白表达下调。给药治疗后,结果显示甘草附子汤能明显改善大鼠疼痛指数和关节宽度;降低灌洗液中MMP-3、TNF-α和IL-1β的含量,升高TIMP-1的含量;改善关节损伤,使关节面变得平滑,关节腔间隙变小,减少滑膜组织炎症发生;能显著下调软骨组织中MMP-3和Bax蛋白表达,上调软骨组织中Bcl-2蛋白表达。3.蛋白质组学分析结果显示,各组之间的蛋白进行比较后筛选出差异蛋白273个,KEGG分析发现上述差异蛋白共涉及Systemic lupus erythematosus等43条信号通路,其中与骨关节炎相关的信号通路有11条。4.结果显示,9μM MIA诱导2h软骨细胞存活率在50%-70%,可以作为后续试验的造模条件。MIA刺激后,软骨细胞培养基中丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、TNF-α、IL-1β和MMP-3含量升高,超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）活力和TIMP-1含量显著下降;软骨细胞中MMP-3和Bax蛋白表达上调;给予甘草附子汤含药血清后,能显著改善MIA对软骨细胞增殖的抑制作用,降低培养基中MDA,TNF-α,IL-1β,MMP-3的含量,升高SOD活力和TIMP-1含量;减少软骨细胞中的MMP-3和Bax蛋白的表达,提高细胞内Bcl-2/Bax的比值,改善细胞凋亡情况。加入LY294002阻断PI3K/Akt信号通路后,MMP-3含量升高,给予甘草附子汤含药血清后MMP-3含量下降。结论:1.甘草附子汤水煎剂中化学成分较多,应用液质联用技术共找出489个化合物,主要分别为黄酮类、萜类、香豆素及其衍生物、苯丙素类等。其中甘草苷、甘草酸、肉桂酸和香豆素四种主要有效成分,在一定条件下,用高效液相色谱法能将它们良好分离。2.甘草附子汤能改善大鼠骨关节炎疼痛和关节肿胀,通过降低大鼠体内活性氧含量,减少关节腔内炎症因子含量,抑制软骨细胞的凋亡,对关节软骨组织有保护作用。3.应用蛋白质组学法,筛选出各组的差异蛋白,并对差异蛋白的功能及参与的信号通路进行探讨,提示甘草附子汤可能通过调节PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路等炎症相关通路和凋亡相关通路的蛋白表达,来达到治疗骨关节炎的作用。4.甘草附子汤含药血清能促进软骨细胞增殖,降低软骨细胞氧化应激水平和炎症水平,抑制软骨细胞的凋亡,对MIA抑制软骨细胞功能具有保护作用,其机制可能是通过调节PI3K-Akt信号通路相关蛋白的表达。