论文部分内容阅读
研究背景:肾小管间质纤维化（tubulointerstitial fibrosis,TIF）是影响慢性肾脏病（chronic kiney disease,CKD）向终末期肾衰竭（end stage renal disease,ESRD）进展的重要因素,目前对引起TIF发生发展的分子机制尚不完全清楚,临床上也缺乏有效治疗手段。因此,进一步阐明TIF的发病机制,对于防治CKD的进展具有重要意义。细胞外基质（extracellular matrix,ECM）过度沉积是TIF的特征,而肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）为ECM产生增多的重要因素。成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2,FGF2）参与肿瘤及器官纤维化的EMT进程,且在多种肾脏疾病中表达升高,但是其在TIF发病中的作用及机制尚不清楚。有研究发现,FGF2可以在多种疾病状态下激活信号转导和转录活化因子3（signal transduction and transcriptional activation factor 3,STAT3）,而在TIF中尚未见报道。STAT3为转录因子,我们通过生物学软件预测STAT3可能与Yes-相关蛋白1（Yes-related protein 1,YAP1）的启动子区域存在结合位点,调控YAP1的转录。因此本研究在人体、动物及细胞中探讨FGF2是否可以通过活化STAT3而调控YAP1的转录促进肾小管上皮细胞发生EMT导致肾间质纤维化的发生,观察体内敲低FGF2可否延缓TIF的进展。以期进一步阐明肾小管间质纤维化的发病机制,为防治CKD探寻新的有效靶点。目的:1、初步观察FGF2在TIF肾组织中的表达情况,明确FGF2在肾小管间质纤维化中的作用;2、进一步探讨FGF2是否可以通过活化STAT3而调控YAP1的转录,从而促进肾小管上皮细胞发生EMT转变,最终导致肾间质纤维化的发生,明确FGF2在肾小管间质纤维化中发挥作用的潜在分子机制;3、观察敲低FGF2是否可以抑制肾小管间质纤维化进程,以期为CKD的防治探寻新靶点。方法:1、观察FGF2在TIF肾组织中的表达及作用:临床中收集肾活检的TIF患者切片,SD大鼠行单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction,UUO）建立TIF模型,采用HE染色和Masson染色观察肾脏组织形态和胶原蛋白沉积情况;免疫组化和/或Western blot法检测TIF患者肾组织切片和UUO肾组织中FGF2的表达情况;采用FGF2细胞因子刺激NRK-52E细胞,细胞免疫荧光和Western blot法检测α-SMA、ColⅢ蛋白的表达变化,观察FGF2对肾小管上皮细胞EMT的影响;在小鼠体内肾脏原位注射携带FGF2敲低质粒的腺相关病毒,并行UUO术,使用免疫组化、免疫荧光及Western blot法观察体内敲低FGF2后,肾组织FGF2、Col I、α-SMA蛋白表达的变化,观察体内敲低FGF2对TIF进程的影响。2、观察FGF2是否通过激活STAT3信号通路而促进TIF进展:免疫组化和/或Western blot法观察TIF患者肾组织切片和UUO肾组织中STAT3、p-STAT3的表达部位及量;FGF2细胞因子刺激NRK-52E细胞,Western blot法及细胞免疫荧光法检测STAT3、p-STAT3蛋白的表达变化;当转染si-STAT3及使用STAT3磷酸化抑制剂STATTIC后,Western blot法观察敲低STAT3或抑制STAT3活化后对FGF2刺激NRK-52E细胞发生EMT的影响;使用FGFR的Ⅰ型及Ⅱ型受体抑制剂,Western blot法观察FGF2激活STAT3蛋白的受体途径;免疫组化、免疫荧光及Western blot法观察小鼠体内敲低FGF2后,STAT3及p-STAT3蛋白表达的变化。3、观察FGF2激活STAT3信号通路后是否可以通过促进YAP1的转录而最终调控TIF的进程:免疫组化和/或Western blot法观察TIF患者肾组织切片和UUO大鼠肾组织中YAP1的表达情况;FGF2细胞因子刺激NRK-52E细胞,使用Western blot法及细胞免疫荧光法检测YAP1蛋白的表达变化;Western blot法观察使用si-STAT3及STATTIC后,对FGF2刺激NRK-52E细胞YAP1蛋白表达的影响;采用胞浆胞核蛋白分离技术,Western blot法检测FGF2刺激NRK-52E细胞后胞浆及胞核中Total-YAP1、p-YAP1及Active-YAP1的蛋白表达情况;q PCR法检测UUO术后STAT3及YAP1的m RNA水平并观察两者之间的相关性;双荧光素酶报告基因检测（Luciferase）及染色质免疫共沉淀法（Ch IP）检测大鼠肾小管上皮细胞中STAT3与YAP1启动子之间的结合位点及强度,检测STAT3对YAP1启动子的转录调控作用;并在NRK-52E细胞中过表达STAT3后,Western blot及q PCR法检测YAP1蛋白及m RNA的表达情况;且在NRK-52E细胞中转染si-YAP1,Western blot法检测敲低YAP1对FGF2刺激细胞后YAP1、CTGF、α-SMA、ColⅢ蛋白表达的变化;免疫组化、免疫荧光及Western blot法观察小鼠体内敲低FGF2后,YAP1蛋白表达的变化。结果:1、FGF2在TIF肾组织中表达明显升高并促进TIF的进展HE及Masson染色均可观察到,TIF患者肾组织切片及UUO术大鼠肾小管间质有炎症细胞浸润及胶原蛋白沉积;免疫组化和Western blot结果提示患者或大鼠TIF时,肾组织FGF2较对照组表达均明显升高（P<0.05）;当细胞因子FGF2刺激NRK-52E细胞后,细胞免疫荧光和Western blot法均提示α-SMA、ColⅢ蛋白的表达较正常组明显升高（P<0.05）,提示FGF2可以促进肾小管上皮细胞发生EMT;体内敲低小鼠肾脏FGF2后行UUO术,免疫组化、免疫荧光及Western blot法提示,FGF2敲低可以明显降低肾组织中FGF2、Col I、α-SMA的蛋白表达,提示敲低FGF2可以减缓TIF的进程。2、FGF2通过激活STAT3信号通路而促进TIF进展免疫组化和Western blot结果提示TIF患者肾组织切片p-STAT3和UUO肾组织中STAT3、p-STAT3的表达明显升高（P<0.05）;FGF2刺激NRK-52E细胞后,Western blot及细胞免疫荧光均提示STAT3蛋白无明显变化但p-STAT3蛋白表达明显升高（P<0.05）;Western bolt提示使用si-STAT3及STATTIC后,可以明显降低FGF2诱导NRK-52E细胞发生的EMT转变（P<0.05）;使用FGFR受体的I型及Ⅱ型受体抑制剂,结果表明FGF2通过作用于胞膜上的FGFR2受体而影响STAT3蛋白的激活;免疫组化、免疫荧光及Western blot法观察小鼠体内敲低FGF2后,STAT3及p-STAT3蛋白表达均明显减少（P<0.05）。3、FGF2激活STAT3信号通路后促进YAP1的转录而最终导致TIF的发生发展免疫组化和Western blot法提示TIF患者肾组织切片和UUO肾组织中YAP1的表达较正常组均明显升高（P<0.05）;Western blot法及细胞免疫荧光法提示,使用FGF2刺激NRK-52E细胞,YAP1蛋白的表达明显升高（P<0.05）;Western blot法检测FGF2刺激NRK-52E细胞后胞浆及胞核中Total-YAP1、及Active-YAP1蛋白表达量均明显升高（P<0.05）;Western blot法显示使用si-STAT3及STATTIC后,FGF2刺激NRK-52E细胞增多的YAP1蛋白表达明显下降（P<0.05）;q PCR法检测UUO术后STAT3及YAP1的m RNA水平较对照组明显升高（P<0.05）,且两者之间正相关（P<0.05）;采用双荧光素酶报告基因检测（Luciferase）及染色质免疫共沉淀法（Ch IP）检测大鼠肾小管上皮细胞STAT3可以与YAP1启动子的RE1及RE3序列结合,调控YAP1的转录;在NRK-52E细胞中过表达STAT3后,Western blot及q PCR法提示YAP1蛋白及m RNA的表达明显升高（P<0.05）;NRK-52E细胞中转染si-YAP1,Western blot提示敲低YAP1可以明显减轻FGF2刺激细胞引起的CTGF及纤维化指标α-SMA、ColⅢ蛋白的升高（P<0.05）;小鼠体内敲低FGF2后,免疫组化、免疫荧光及Western blot法提示YAP1蛋白表达明显减少（P<0.05）。结论:1、FGF2在TIF肾组织中表达明显升高,可以促进肾小管上皮细胞发生EMT而导致肾间质纤维化的发生;2、FGF2可能是通过活化STAT3而调控YAP1的转录,从而促进肾小管上皮细胞发生EMT转变,最终导致TIF的发生;3、敲低FGF2可以抑制肾小管间质纤维化进程,可作为CKD治疗的潜在靶点。