绿僵菌素A（destruxin A,DA）是金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae产生的一种环缩羧肽类次生化合物,具有较好的杀虫活性和抗免疫作用,但其分子作用机理尚不清楚。在前期研究中,本实验室采用DA处理家蚕Bm12细胞,利用蛋白酶解和电泳分离了特异性蛋白条带,通过质谱分析与MOE2014软件分子模拟技术鉴定了100多种疑似与DA有亲和作用的蛋白质。为了进一步研究这些蛋白与DA的互作关系,本实验选取了其中4种蛋白质（Bm_nscaf2970₀87（P07）、Bm_nscaf2204₁40（P20）、Bm_nscaf2993₀29（P27）、Bm_nscaf2971₀8（P37））为对象,首先构建其Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,转染草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda SF-9细胞,应用亲和层析技术分离纯化这4种家蚕蛋白;同时,采用昆虫双杂系统（insect two-hybrid system）研究DA与目标蛋白的互作关系。主要研究结果如下:（1）家蚕蛋白基因的克隆与表达在NCBI数据库中比对家蚕蛋白Bm_nscaf2970₀87（P07）、Bm_nscaf2204₁40（P20）、Bm_nscaf2993₀29（P27）以及Bm_nscaf2971₀8（P37）,查找相应同源基因序列,设计合成引物,添加His标签。从家蚕Bm12细胞中提取总RNA,进行第一链c DNA的合成,利用一步克隆（P20和P27蛋白基因）和传统双酶切技术（P07和P37蛋白基因）构建重组表达载体pFast-Bac^TM1,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统完成重组昆虫杆状病毒的构建,扩增杆状病毒株,转染SF-9细胞,表达目标蛋白。目前,P27、P07、P37蛋白已经完成了真核表达。观察细胞转染过程发现,转染后细胞形态发生明显的变化,转染24h,细胞直径增大25⁵0%,细胞核增大,可能充满整个细胞;转染24⁷2h,细胞停止增长,不再增大,细胞内出现颗粒体并且脱离培养瓶,处于悬浮状态。转染72h,细胞出现消亡,单层细胞开始出现。（2）蛋白分离纯化与质量检查放大培养已感染重组杆状病毒的SF-9细胞,进行细胞蛋白的粗提取。亲和层析分离纯化目标蛋白,用His-抗体通过Western blot检验分离纯化的目标蛋白,结果发现,P20和P27蛋白条带的大小与理论值81626.21Da和56339.37Da相吻合。对这两种蛋白进行大量的提取分离和纯化,其中,P27蛋白质已经进行了3次分离纯化,蛋白浓度分别为10mg·mL^-1、80 mg·mL^-1、40 mg·mL^-1,纯度分别为90%、70%、40%,P20与P37蛋白正在纯化中,P07蛋白基因已经导入目的载体pFast-Bac^{T M}1上保存。（3）DA与P27蛋白的互作研究通过生物学信息分析,P27蛋白是一种清道夫受体家族蛋白,与家蚕血淋巴蛋白酶HP14有相互作用,本研究采用昆虫双杂系统,研究了DA对P27蛋白互作功能的影响。先将上述基因的PCR产物与TOPO载体进行BP反应,构建入门载体;再将构建好的入门载体,分别与PIE-AD,PIE-BDB载体在LR酶中进行反应,构建成目的载体PIE-AD-P27与PIE-DBD-HP14;然后将目的载体与带有荧光素酶基因的载体PIE-LUC同时转染SF-9细胞,12 h后分别用0.002、0.02、0.2、2、20、50、100、200mg·L^-1的DA处理转染细胞48h。结果发现,无DA处理组的荧光值（CK）显著高于处理组的荧光值,且荧光值与DA处理剂量具有负相关性,当DA处理浓度为200、2、0.02、0.002和0 mg·L^-1（CK）时,荧光值分别为30.7、37.3、61.3、、305.3、1237.3。说明DA影响P27蛋白与HP14蛋白的互作,也就是说DA与P27蛋白之间存在相互作用,P27蛋白是一种DA结合蛋白。（4）球孢白僵菌对亚洲玉米螟血细胞毒力和形态的影响采用MTT和CCK-8法测定球孢白僵菌对亚洲玉米螟血细胞系SYSU-OfHe-C的毒力,通过光学显微镜与扫描电镜观察球孢白僵菌生长及其对SYSU-OfHe-C细胞形态的影响。球孢白僵菌分生孢子处理SYSU-OfHe-C细胞24 h后,MTT法的测得的IC₅₀值为2.8×10⁵ mL^-1,CCK-8法的IC₅₀值为1.4×10⁵ mL^-1。光学显微镜实时监测发现,在SYSU-OfHe-C细胞对数期接种球孢白僵菌浓度为3.5×10⁴ mL^-1,球孢白僵菌具有明显竞争力,未发现囊胞化与吞噬等细胞免疫现象,处理10 h后球孢白僵菌分生孢子开始萌发长出菌丝,而SYSU-OfHe-C细胞开始变形和减少,至24 h,球孢白僵菌几乎长满整个视野。球孢白僵菌可引起SYSU-OfHe-C细胞从近似圆形变长或者变为不规则形状,出现聚集、破碎、胞内空泡、瘤状突起,以及被白僵菌菌丝穿透等现象。