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棉铃虫是属于鳞翅目,夜蛾科的一种抗性极强的杂食性农业害虫,对许多重要的经济作物,包括棉花、蔬菜的生长都有较大的危害。随着杀虫剂的长期使用,棉铃虫对许多农药,甚至是苏云金芽孢杆菌(Bt)都产生了一定的抗性。因此,为了促进农业的可持续绿色发展,安全、高效的新型生物杀虫剂迫切需要研制。研究表明,胆固醇对棉铃虫自身的生长发育至关重要,但是棉铃虫不能利用自身的物质来合成胆固醇,必需从外界获取胆固醇来满足其生长发育的需要,而固醇载体蛋白SCP-2在昆虫固醇的吸收和运输过程中扮演着非常关键的角色。本实验室前期已经克隆鉴定了棉铃虫固醇载体蛋白(HaSCP-2)基因,并通过核磁共振技术研究了该蛋白结构,但有关HaSCP-2基因表达调控的机制目前尚不清楚。本研究从两个方面展开,一方面运用突变、细胞转染、蛋白表达、EMSA、实时荧光定量PCR,RNA干扰等实验技术手段,研究顺式作用元件E-box、转录因子HaAP-4对HaSCP-2基因启动子的调控作用。取得了如下的实验结果:(1)构建含有HaSCP-2启动子上游400 bp序列的pGL3-400 bp荧光素酶重组质粒,突变位于该400 bp区域的E-box元件,转染棉铃虫Ha细胞并检测荧光素酶活性,结果显示,突变E-box元件后,HaSCP-2启动子的活性被显著下调了约70%;(2)构建表达HaAP-4的OpIE2-AP-4-his-N 1重组质粒,转染Ha细胞测酶活,数据显示棉铃虫HaAP-4的超表达对HaSCP-2启动子起正调控作用;(3)通过设计HaAP-4 siRNA,转染Ha细胞,实时荧光定量PCR检测HaAP-4和HaSCP-2 mRNA转录水平,结果表明干扰HaAP-4的表达,使得HaSCP-2 mRNA转录水平显著下降,进一步说明了HaAP-4对HaSCP-2的表达起着促进作用;(4)利用pET-28a原核表达载体,成功表达了 HaAP-4蛋白,大量纯化该蛋白,并免疫家兔制备了抗体;(5)通过凝胶电泳迁移实验(EMSA)探究HaAP-4蛋白与E-box序列的相互作用,结果表明转录因子HaAP-4能与HaSCP-2启动子区的E-box序列进行特异性结合,从而调控HaSCP-2基因的特异性表达。另一方面,本研究从棉铃虫虫体水平对HaAP-4以及HaSCP-2的功能进行了进一步研究。取得以下主要结果:(1)通过向活体棉铃虫注射干扰HaAP-4表达的小RNA,提取中肠RNA,实时荧光定量PCR检测虫体水平HaAP-4和HaSCP-2的表达情况。实验结果显示,向棉铃虫幼虫注射siRNA,抑制了虫体HaAP-4的表达,同时HaSCP-2的表达也相应显著减少,说明HaAP-4对HaSCP-2蛋白的表达起着促进作用;(2)解剖RNAi干扰后棉铃虫幼虫的脂肪体组织,利用胆固醇测定试剂盒,测定了其胆固醇含量,结果表明,注射siRNA的实验组棉铃虫胆固醇的含量明显低于注射DEPC水的对照组。说明干扰转录因子HaAP-4后,由于HaSCP-2表达受到抑制,进而引起棉铃虫体内胆固醇吸收量的下降,这与报道中HaSCP-2在昆虫吸收外源胆固醇过程中发挥作用的结论是一致的,也进一步证明了 HaAP-4通过调控HaSCP-2的表达,影响棉铃虫对胆固醇的吸收;(3)在虫体水平HaAP-4基因的干扰实验中,我们还对棉铃虫的生长发育情况,包括棉铃虫体重、生长速度、化蛹和羽化等方面进行了记录、统计和分析,结果发现干扰HaAP-4基因后,棉铃虫的生长发育和繁殖等产生了一定的显著变化,推测转录因子HaAP-4能通过调控HaSCP-2的表达,影响棉铃虫胆固醇的吸收与利用,进一步影响棉铃虫的生长发育过程。本文研究了 HaSCP-2启动子区E-box调控元件的功能,探讨了转录因子HaAP-4对HaSCP-2基因的调控作用,并在虫体水平上进一步验证了 HaAP-4对HaSCP-2的调控以及对棉铃虫吸收胆固醇、棉铃虫生长发育的影响。本研究的结果,不仅为研究昆虫HaSCP-2的转录调控机制打下了重要的基础,同时也为开发新型高效的杀虫剂提供了重要的理论数据。