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研究目的:葡萄糖代谢异常是引发代谢相关疾病的重要因素之一。众所周知,规律的有氧运动是防治机体肥胖、胰岛素抵抗(IR)和2型糖尿病(T2DM)的有效手段。机体运动主要是通过骨骼肌收缩和舒张来完成,人体内约80%由胰岛素介导的葡萄糖转运和利用是由骨骼肌组织完成,因此,促进骨骼肌细胞葡萄糖代谢能够增强机体组织对胰岛素的敏感性,改善IR、预防T2DM的发生。Ⅱ型组蛋白去乙酰化酶(HDACs)作为转录抑制因子对组织细胞葡萄糖代谢起着重要的调节作用,Ⅱ型组蛋白去乙酰化酶中的HDAC4和HDAC5是运动敏感性的组蛋白去乙酰化酶。有氧运动作为预防和治疗肥胖、IR和多种代谢性疾病的有效手段,其作用机理是否与骨骼肌组织Ⅱ型HDACs的调控有关目前尚不完全明了。本研究以Ⅱ型HDACs调控组织细胞葡萄糖代谢为线索、以在体动物模型和离体细胞模型为对象,研究HDAC4和HDAC5在有氧运动改善骨骼肌细胞葡萄糖摄取及利用的作用机制。通过在体动物实验和离体细胞培养相结合的方式,研究有氧运动对C57BL/6小鼠骨骼肌细胞HDAC4和HDAC5调控葡萄糖转运体4(GLUT4)基因表达相互作用关系的影响;并在离体状态下探讨微小RNA-206(mi R-206)调节氧化型骨骼肌细胞HDAC4基因表达的具体机制,同时本研究还采用一磷酸腺苷活化蛋白激酶α2(AMPKα2)基因敲除小鼠,研究在AMPKα2缺失的情况下骨骼肌细胞HDAC4和HDAC5调控细胞葡萄糖代谢的变化,为进一步揭示HDAC4和HDAC5在骨骼肌细胞葡萄糖代谢中的作用机制提供理论依据。研究方法:1.动物模型的建立5周龄、雄性C57BL/6小鼠随机分为正常安静组(NC)和正常运动组(NE)。5周龄AMPKα2基因敲除小鼠共有三种基因型,即野生型(WT)、杂合子型(AMPKα2+/-)和纯合子型(AMPKα2-/-)。分别将各基因型小鼠随机分为安静对照组(C)和有氧运动组(E)。2.腺病毒的构建利用Gateway克隆技术构建HDAC4,HDAC5,MEF2A和AMPKα2过表达重组腺病毒质粒,采用Pac I内切酶线性化后转染293A细胞进行腺病毒包装。AMPKα2显性负突变腺病毒是通过Gateway克隆技术构建过表达质粒后进行点突变,再进行腺病毒载体的重组及包装。3.细胞培养及干预小鼠肌原细胞系C2C12经2%马血清培养诱导分化为肌管细胞。观察HDAC4,MEF2A和HDAC5过表达腺病毒以及HDAC4和HDAC5 si RNA干预肌管细胞对葡萄糖代谢的影响;检测AMPKα2过表达腺病毒及AMPKα2显性负突变腺病毒对肌管细胞HDAC4的影响;使用mi R-206 mimic和mi R-206 inhibitor转染肌管细胞,观察葡萄糖代谢的变化。4.生化指标检测采用Real-time PCR检测基因表达;采用Western Blot方法检测蛋白表达;使用2-脱氧葡萄糖荧光类似物(2-NBDG)检测C2C12肌管细胞葡萄糖摄取能力;采用免疫共沉淀(Co-IP)检测蛋白间的相互结合;采用免疫荧光检测蛋白表达及细胞内定位。研究结果:1.HDAC4/5在有氧运动改善骨骼肌糖代谢中的作用6周有氧运动可以显著增加小鼠骨骼肌组织GLUT4 m RNA和蛋白表达、HDAC4 Ser246位点磷酸化,同时促进HDAC4从细胞核转移至胞浆。通过离体细胞实验发现肌管细胞HDAC4表达的增加可抑制细胞GLUT4转录及其对葡萄糖摄取能力,当增加MEF2A的表达水平可逆转HDAC4的抑制作用。HDAC4 si RNA显著增加肌管细胞GLUT4基因转录水平,在此基础上给予HDAC5 si RNA,GLUT4基因转录水平被大幅度提高。与之相反,同时过表达HDAC4和HDAC5对于C2C12肌管细胞GLUT4的转录抑制效率显著高于单独过表达HDAC4或HDAC5。由此推测,骨骼肌细胞HDAC4与HDAC5可能在GLUT4的转录调控过程中发挥着协同作用。有氧运动显著降低氧化型肌纤维HDAC4和HDAC5蛋白表达,然而在酵解型肌纤维中却无显著变化。此外,有氧运动也显著降低骨骼肌细胞HDAC4和HDAC5的相互结合(图1.8)。由此提示,有氧运动对HDAC4和HDAC5蛋白表达调控具有肌纤维类型的特异性,对其下游靶基因的抑制作用可能与二者的相互结合有关。2.AMPKα2在有氧运动调控骨骼肌组织HDAC4/5中的作用离体状态下敲低AMPKα2可导致HDAC4 Ser246/632位点的磷酸化水平显著降低,促使HDAC4从细胞核转移至胞浆。提示骨骼肌细胞AMPKα2是HDAC4的上游激酶。单次有氧跑台运动可以激活野生型小鼠骨骼肌AMPK-HDAC4信号通路;然而有氧运动未能增加AMPKα2缺失小鼠骨骼肌HDAC4 Ser246/632磷酸化水平,提示运动对于骨骼肌组织HDAC4的激活依赖于AMPKα2。3.mi R-206介导HDAC4在有氧运动提高骨骼肌葡萄糖代谢中的作用机制6周的有氧运动显著增加氧化型肌纤维mi R-206的表达水平、抑制HDAC4蛋白表达、显著增加GLUT4 m RNA及蛋白表达。由此推测有氧运动可能通过mi R-206降低HDAC4的蛋白表达,进而增加骨骼肌细胞GLUT4的转录。离体研究发现,mi R-206水平的增高可显著降低HDAC4的蛋白表达、增加骨骼肌细胞GLUT4基因的转录、提高了骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取。因此提示mi R-206可能通过抑制HDAC4促进骨骼肌细胞GLUT4的转录,进而增加了对葡萄糖的摄取能力。采用mi R-206 mimic和HDAC4 si RNA共转染肌管细胞,发现mi R-206和GLUT4的转录水平显著低于单独使用mi R-206 mimic干预的肌管细胞。随后检测发现,采用HDAC4 si RNA可显著降低C2C12肌管细胞mi R-206的表达水平,甚至与mi R-206 inhibitor干预后结果无显著差异。由此说明,HDAC4si RNA反馈性的抑制骨骼肌细胞mi R-206的表达。此外,以不同浓度梯度mi R-206 mimic孵育肌管细胞,GLUT4的基因表达随着浓度梯度增加而增加,之后转染肌管细胞过表达HDAC4腺病毒,GLUT4基因表达虽显著高于对照组,但显著低于单独使用mi R-206 mimic干预组,提示mi R-206通过HDAC4调控肌管细胞GLUT4的基因表达。研究结论:1.HDAC4通过MEF2A调控骨骼肌细胞GLUT4的基因转录,且在转录调控的过程中HDAC4/5可能发挥着协同作用。有氧运动对于HDAC4/5的影响具有肌纤维类型的特异性,唯有在氧化型肌纤维中的表达水平显著降低,可能是有氧运动促进骨骼肌有氧氧化,提高机体对糖脂代谢的重要机制。2.AMPK能够调控骨骼肌细胞HDAC4活性。单次有氧运动通过AMPKα2所依赖的方式激活骨骼肌细胞HDAC4。3.mi R-206 mimic显著抑制骨骼肌细胞HDAC4的蛋白表达,同时增加GLUT4转录、促进骨骼肌对葡萄糖的摄取。此外,有氧运动可能通过mi R-206调控氧化型肌纤维HDAC4的蛋白表达、促进机体的葡萄糖代谢。