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目的:
通过观察半枝莲醇提物含药血清对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)的作用与影响,探讨半枝莲醇提物对大鼠HSC-T6作用,通过观察α-SMA、Ⅰ型、Ⅲ型胶原的含量、TGF-β1等指标的变化来研究其对大鼠HSC-T6合成和降解ECM的作用,为进一步研究半枝莲抗肝纤维化作用提供数据支持。
方法:
采用半枝莲生药4倍量的70%乙醇加热回流提取3次,每次1小时,得到的半枝莲醇提物浸膏在60℃水浴将乙醇蒸发后,4度冰箱保存。随机选择SD大鼠25只,每只体重约250g左右,随机分成5组:正常血清对照组(A组)5只,半枝莲高剂量组(B组)5只,半枝莲中剂量组(C组)5只,半枝莲低剂量组(D组)5只,秋水仙碱灌胃组(E组)5只,其中A组给予等量的生理盐水灌胃。灌胃开始前一周自由饮食,适应环境。灌胃方法:采用通法给药方案,给药前禁食不禁饮4小时,每日灌胃给药2次,连续给药3日,末次给药1h后采血,分离出含药血清,灭活后过滤除菌,-20℃冰箱保存。以含10%胎牛血清的DMEM将处于对数生长期的HSC-T6稀释制备为1×105个细胞/ml悬液,按1ml/孔添加细胞悬液于六孔板培养皿中孵育24h,孔内预先放置20mm×20mm盖玻片,待细胞完全贴壁后进行试验分组。具体试验分组:空白对照组(a)、高浓度半枝莲含药血清组(b)、中度半枝莲含药血清组(c)、低浓度半枝莲含药血清组(d)、秋水仙碱含药血清组(e)共5组。以每块六孔板为1组,共测试4个指标,每块盖玻片用做一种蛋白的免疫组化染色,重复3次。添加含药血清方法:用DMEM(不含胎牛血清)按1∶10的比例将各组大鼠血清稀释,配置浓度为10%大鼠含药血清工作液;将配置好的工作液按2ml/孔添加到对应各组培养板中,孵育24h。用4%多聚甲醛固定后捞起盖玻片风干后,用细胞酶免疫组织化学方法染色观察Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、α-SMA、TGF-β1沉积的部位和面积。
结果:
1.高、中、低半枝莲组、秋水仙碱组分别于空白组比较,各组HSC-T6细胞的Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、α-SMA和TGF-β1这四种蛋白的表达水平均下调,表达的相对面积缩小,颜色从棕黄色变为浅黄色,比较差异有统计学意义(P<0.05)。
2.高、中、低半枝莲组与秋水仙碱组对比,其中高剂量半枝莲组的四种蛋白的表达水平均明显低于秋水仙碱组,差异有统计学意义(P<0.01)。
结论:
1.半枝莲醇提物具有降低HSC-T6细胞表达Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、α-SMA和TGF-β1水平的能力,从而抑制了ECM的形成。
2.高剂量的半枝莲醇提物,在抑制HSC-T6降低HSC-T6细胞的蛋白分泌功能方面能力较秋水仙碱强。