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目的：
对免疫化学联合法加上高脂辛辣饲料喂养，并佩戴颈环制备的心脾积热型RAU大鼠进行研究，观察模型大鼠口腔粘膜组织病理学的改变、体重的变化、临床表现和给予愈口宁高、中、低剂量后的变化，从分子水平探讨心脾积热型RAU大鼠模型的发病机制，愈口宁对调节Th1/Th2免疫平衡的作用机制以及与JAK/STAT信号通路的相关性，为愈口宁治疗心脾积热型RAU的应用价值提供实验依据。
方法：
1.理论研究：
通过查阅国内外相关文献，探讨RAU的中医病名、病因病机、中医辨证论治及专方治疗，并从西医的角度探讨RAU的病名由来、病因、临床表现与西医治疗方法。
2.实验研究：
60只SD大鼠，进行适应性饲养一周后，随机抽出10大鼠用10％的水合氯醛进行麻醉,颈椎脱臼处死，制备口腔黏膜组织匀浆。取口腔黏膜匀浆适量，按1：1的比例与弗氏完全佐剂混匀获得免疫抗原乳化剂,现配现用。将余下的50只大鼠随机分成5组，对照组、模型组、愈口宁高剂量组、愈口宁中剂量组、愈口宁低剂量组，每组10只。除对照组（单笼颗粒饲料饲养自由饮水）外，均采用单笼高脂辛辣饲料饲养，佩戴颈环。连续14天后，4组大鼠背部脱毛，皮内注射免疫抗原乳化剂，每周注射1次抗原,共8周。在第一次注射后的第54天,用50％冰醋酸灼烧下唇黏膜30s，48h后各组大鼠进行取材。观察大鼠的主要症状与体征变化，组织病理学改变，流式细胞仪检测各组大鼠脾脏T淋巴细胞变化，口腔粘膜组织进行实时荧光定量PCR检测和Western blot分析。采用SPSS23.0统计软件进行数据分析。
结果：
1.大鼠的主要症状与体征:
心脾积热证建模后大鼠体毛粗糙,性情暴躁不安,部分鼻衄，但见鼻孔血痕，齿龈略红肿，牙齿干燥，大便干结,小便色黄加重,反应迟钝,摄食和饮水量减少，下唇粘膜均出现圆形或椭圆形的溃疡。与对照组相比，模型组在停止造模刺激后，体重总体呈缓慢下降趋势。而低剂量的愈口宁组体重没有明显增加,呈现波动趋势；愈口宁高、中剂量组体重总体呈上升趋势。
2. HE的改变：
在显微镜下可见,对照组口腔黏膜上皮层、基底膜、固有层层次清晰,结构明显。造模后各组给予相应剂量的药物治疗，与模型组相比，可以观察到各组均出现上皮粘膜的修复。而低剂量组和模型组可见上皮细胞内及细胞间的水肿,基底膜清晰。
3.流式细胞仪检测各组大鼠脾脏T淋巴细胞的变化：
与对照组相比，模型组的脾脏显示IFN-γ T细胞（Th1）生成比率上升;而在各组药物治疗后，细胞生成比率均呈显著下降趋势。与之相反的是，模型组大鼠在Th2细胞中显示出完全不同的趋势，与对照组相比，IL-4 T细胞（Th2）生成比率明显下调。而各组药物治疗后 Th2细胞的下调比率均呈上升趋势。研究提示我们，愈口宁高、中、低剂量均可通过增加心脾积热型RAU大鼠脾脏中Th2的表达，抑制脾脏中Th1的表达，来调节心脾积热型RAU大鼠Th1/Th2的平衡。
4.口腔粘膜组织进行实时荧光定量PCR检测
与对照组相比，心脾积热型 RAU大鼠模型中 IFN-γ表达增加。然而在各组给予愈口宁后，细胞因子IFN-γ的mRNA表达显著降低了。在心脾积热型RAU口腔粘膜组织中，T-bet在药物治疗后显示mRNA表达降低，而这又促进了GATA-3的mRNA表达。这些结果表明，愈口宁通过增加Th2-相关细胞因子和转录因子的mRNA表达来预防心脾积热型RAU口腔粘膜的炎症。
5.口腔粘膜组织采用Western blot分析
在模型组的大鼠中，p-STAT1的表达上调，而它们在给药后均显著下调。但是，给药导致心脾积热型RAU大鼠的口腔粘膜组织中STAT1的总表达没有改变。与对照组相比，模型组中观察到p-STAT6表达下调。这种下降在各组给予愈口宁后显著上调，但是这并没有导致 STAT6总表达的改变。总之，这些结果表明，JAK/STAT信号通路的改变可以在一定程度上阐明愈口宁药物的生物活性对心脾积热型RAU大鼠Th1/Th2免疫应答的影响。
结论：
1.复发性阿弗他溃疡最常见的证型是心脾积热型，治法宜清热解毒，消肿止痛，应用中药方剂愈口宁有效。
2.免疫化学联合法加上高脂辛辣饲料饲养，并佩戴颈环，可出现复发性阿弗他溃疡的临床症状，其证候为心脾积热型，提示造模成功可复制。3.在RAU的口腔粘膜中发现，Th1细胞大量聚集通过作用于p-STAT1激活IFN-γ/STAT1通路；Th2细胞相对缺乏，但IL-4依赖于STAT6诱导Th2细胞分化，进而激活转录因子 GATA-3，提示 RAU的发病可能是通过JAK/STAT信号通路来实现的。
4.愈口宁通过抑制STAT1磷酸化来抑制IFN-γ/STAT1通路，激活p-STAT6来调节Th1/Th2平衡，由此推测中药方剂愈口宁改善心脾积热型RAU大鼠的机制可能与其调控JAK/STAT信号通路有关。
对免疫化学联合法加上高脂辛辣饲料喂养，并佩戴颈环制备的心脾积热型RAU大鼠进行研究，观察模型大鼠口腔粘膜组织病理学的改变、体重的变化、临床表现和给予愈口宁高、中、低剂量后的变化，从分子水平探讨心脾积热型RAU大鼠模型的发病机制，愈口宁对调节Th1/Th2免疫平衡的作用机制以及与JAK/STAT信号通路的相关性，为愈口宁治疗心脾积热型RAU的应用价值提供实验依据。
方法：
1.理论研究：
通过查阅国内外相关文献，探讨RAU的中医病名、病因病机、中医辨证论治及专方治疗，并从西医的角度探讨RAU的病名由来、病因、临床表现与西医治疗方法。
2.实验研究：
60只SD大鼠，进行适应性饲养一周后，随机抽出10大鼠用10％的水合氯醛进行麻醉,颈椎脱臼处死，制备口腔黏膜组织匀浆。取口腔黏膜匀浆适量，按1：1的比例与弗氏完全佐剂混匀获得免疫抗原乳化剂,现配现用。将余下的50只大鼠随机分成5组，对照组、模型组、愈口宁高剂量组、愈口宁中剂量组、愈口宁低剂量组，每组10只。除对照组（单笼颗粒饲料饲养自由饮水）外，均采用单笼高脂辛辣饲料饲养，佩戴颈环。连续14天后，4组大鼠背部脱毛，皮内注射免疫抗原乳化剂，每周注射1次抗原,共8周。在第一次注射后的第54天,用50％冰醋酸灼烧下唇黏膜30s，48h后各组大鼠进行取材。观察大鼠的主要症状与体征变化，组织病理学改变，流式细胞仪检测各组大鼠脾脏T淋巴细胞变化，口腔粘膜组织进行实时荧光定量PCR检测和Western blot分析。采用SPSS23.0统计软件进行数据分析。
结果：
1.大鼠的主要症状与体征:
心脾积热证建模后大鼠体毛粗糙,性情暴躁不安,部分鼻衄，但见鼻孔血痕，齿龈略红肿，牙齿干燥，大便干结,小便色黄加重,反应迟钝,摄食和饮水量减少，下唇粘膜均出现圆形或椭圆形的溃疡。与对照组相比，模型组在停止造模刺激后，体重总体呈缓慢下降趋势。而低剂量的愈口宁组体重没有明显增加,呈现波动趋势；愈口宁高、中剂量组体重总体呈上升趋势。
2. HE的改变：
在显微镜下可见,对照组口腔黏膜上皮层、基底膜、固有层层次清晰,结构明显。造模后各组给予相应剂量的药物治疗，与模型组相比，可以观察到各组均出现上皮粘膜的修复。而低剂量组和模型组可见上皮细胞内及细胞间的水肿,基底膜清晰。
3.流式细胞仪检测各组大鼠脾脏T淋巴细胞的变化：
与对照组相比，模型组的脾脏显示IFN-γ T细胞（Th1）生成比率上升;而在各组药物治疗后，细胞生成比率均呈显著下降趋势。与之相反的是，模型组大鼠在Th2细胞中显示出完全不同的趋势，与对照组相比，IL-4 T细胞（Th2）生成比率明显下调。而各组药物治疗后 Th2细胞的下调比率均呈上升趋势。研究提示我们，愈口宁高、中、低剂量均可通过增加心脾积热型RAU大鼠脾脏中Th2的表达，抑制脾脏中Th1的表达，来调节心脾积热型RAU大鼠Th1/Th2的平衡。
4.口腔粘膜组织进行实时荧光定量PCR检测
与对照组相比，心脾积热型 RAU大鼠模型中 IFN-γ表达增加。然而在各组给予愈口宁后，细胞因子IFN-γ的mRNA表达显著降低了。在心脾积热型RAU口腔粘膜组织中，T-bet在药物治疗后显示mRNA表达降低，而这又促进了GATA-3的mRNA表达。这些结果表明，愈口宁通过增加Th2-相关细胞因子和转录因子的mRNA表达来预防心脾积热型RAU口腔粘膜的炎症。
5.口腔粘膜组织采用Western blot分析
在模型组的大鼠中，p-STAT1的表达上调，而它们在给药后均显著下调。但是，给药导致心脾积热型RAU大鼠的口腔粘膜组织中STAT1的总表达没有改变。与对照组相比，模型组中观察到p-STAT6表达下调。这种下降在各组给予愈口宁后显著上调，但是这并没有导致 STAT6总表达的改变。总之，这些结果表明，JAK/STAT信号通路的改变可以在一定程度上阐明愈口宁药物的生物活性对心脾积热型RAU大鼠Th1/Th2免疫应答的影响。
结论：
1.复发性阿弗他溃疡最常见的证型是心脾积热型，治法宜清热解毒，消肿止痛，应用中药方剂愈口宁有效。
2.免疫化学联合法加上高脂辛辣饲料饲养，并佩戴颈环，可出现复发性阿弗他溃疡的临床症状，其证候为心脾积热型，提示造模成功可复制。3.在RAU的口腔粘膜中发现，Th1细胞大量聚集通过作用于p-STAT1激活IFN-γ/STAT1通路；Th2细胞相对缺乏，但IL-4依赖于STAT6诱导Th2细胞分化，进而激活转录因子 GATA-3，提示 RAU的发病可能是通过JAK/STAT信号通路来实现的。
4.愈口宁通过抑制STAT1磷酸化来抑制IFN-γ/STAT1通路，激活p-STAT6来调节Th1/Th2平衡，由此推测中药方剂愈口宁改善心脾积热型RAU大鼠的机制可能与其调控JAK/STAT信号通路有关。