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MicroRNA（miRNA）通常作为肿瘤抑制因子和癌基因,与肿瘤的发生和发展密切相关,我们课题组前期的研究发现,叶状肿瘤较乳腺纤维腺瘤,检测到miR-140-3p的表达量明显降低,在人纤维肉瘤细胞系HT1080中过表达miR-140-3p,能够抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。但游离状态的miRNA易被环境中广泛存在的核糖核酸酶所分解,所以欲将miR-140-3p应用到肿瘤的治疗中需保持其稳定不受破坏。细胞外囊泡是从细胞膜上脱落产生的双层膜囊状小体,包括外泌体、微囊泡和凋亡小体,外泌体作为胞外囊泡的一种,直径在30-200nm之间,其双层脂膜结构能够防止miRNA被核糖核酸酶降解,所以使用外泌体包裹miRNA治疗肿瘤有可能成为一个新方向。人初乳中含有丰富的外泌体,但目前尚未发现将人初乳外泌体作为miRNA载体治疗肿瘤的报道。研究目的1.提取人初乳中外泌体并进行验证。2.探究使用人初乳中的外泌体作为治疗性miR-140-3p载体的可行性。研究方法1.收集健康产妇产后1周内的乳汁,使用超速离心法自人初乳中提取出外泌体囊泡。2.鉴定提取的外泌体:①Western blot检测初乳外泌体中的膜蛋白CD9及膜结合蛋白TSG101及细胞核蛋白TFIIB、Lamin A/C的表达情况;②使用透射电子显微镜,观察外泌体的形态大小及膜完整情况;③使用纳米颗粒追踪分析仪,分析外泌体浓度及粒径分布。3.外泌体的荧光标记:PKH67绿色荧光染料标记外泌体膜蛋白,合成miR-140-3p并使用红色荧光Cy3进行标记。通过反复冻融的方式将荧光标记的miR-140-3p转到外泌体中,再与HT1080细胞共同孵育24h,荧光显微镜下观察miR-140-3p是否转入外泌体,是否随外泌体进入细胞中。4.将转入miR-140-3p的外泌体与HT1080细胞孵育24h后,提取细胞中的RNA,实时荧光定量PCR检测miR-140-3p,将其表达情况与空载外泌体组进行对照。结果1.先后共收集健康产妇的初乳14例,分别进行超速离心,BCA法检测到提取物中总蛋白浓度较高。Western blot结果显示初乳提取物中膜蛋白CD9、膜结合蛋白TSG101表达为阳性,核蛋白TFIIB、Lamin A/C均为阴性,符合外泌体的蛋白表达。2.透射电镜显示初乳提取物中可见“杯垫”状形态的囊泡,虽经冻融过程膜结构仍完整,符合正常外泌体形态大小。3.使用纳米颗粒追踪分析仪检测显示:初乳提取物中囊泡的平均直径为197.7±27.6nm,浓度为1.47±0.89×1012 Particles/ml,符合外泌体的直径范围,与本课题组先前测得的成熟乳及乳头溢液的外泌体相比,初乳外泌体粒径较大、浓度更高。4.荧光检测结果显示Cy3标记的miR-140-3p可以通过反复冻融的方式进入人初乳外泌体内,并能通过共同孵育过程进入HT1080细胞中。5.负载miR-140-3p外泌体与HT1080细胞共孵育组,与对照组相比,细胞中miR-140-3p表达明显增加。结论超速离心提取人初乳外泌体具有较高的效率,可以达到外泌体的富集。初乳外泌体可以通过反复冻融的方法转载入miR-140-3p并通过孵育的方法转入人纤维肉瘤细胞内部。人初乳中含有丰富的外泌体可以作为miR-140-3p的载体进行肿瘤的治疗。