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研究背景乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染引起慢性乙型肝炎一直是我国面临的重大公共卫生威胁,乙肝疫苗是预防和控制HBV感染和流行的最有效手段。自2002年起将乙肝疫苗纳入儿童计划免疫以来,我国人群中慢性HBV表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)携带率显著降低。然而,近年来越来越多的学者报道,乙肝疫苗免疫逃避株病毒(vaccine escaped HBV,ve-HBV)的出现已成为影响乙肝防控效果进一步提升的关键所在。研究表明,在HBsAg编码区域中,不仅主要亲水区(Major hydrophilic region,MHR)的一些重要氨基酸如G145R等位点变异是导致ve-HBV的常见重要原因,而且MHR外E2G、L21S和L98V等位点的变异同样会显著影响病毒的复制和分泌。在本研究中我们将分别分析2000-2016年我国HBV/S区MHR内和MHR外突变相关的ve-HBV的分子进化趋势,进一步阐明我国ve-HBV的流行病学特征,从而为更有效的预防和控制HBV的感染和流行提供更多的科学依据。材料与方法(1)根据既往研究结果,将MHR区域内发生I/T126A/N/I/S、Q129H/R、M133L、K141E、P142S、D144A/E 和G145R/A 突变的 HBV 毒株定义为 ve-HBV。首先,收集GenBank中2000-2016间中国地区分离的ve-HBV;其次,采用MEGA 6.06来分析成对距离(p-distance);再次,采用JModeltest分析核苷酸替代模型和站点速率变化模型,使用BEAST v1.6.1的贝叶斯马尔可夫链蒙特卡罗(MCMC)方法分析系统发育进化树和分子进化速率;最后,采用Tracerv1.6来显示ve-HBV的分子进化速度和贝叶斯天际线图(BSP),使用HYPHY程序分析氨基酸位点的选择压力。(2)本研究中231份和348份HBsAg阳性血浆分别采集于苏州市健康体检的非慢性乙肝感染人群和慢性乙肝患者,用于体外中和试验的HBV表面抗体(HBV surface antibody,HBsAb)阳性血清来源于疫苗免疫儿童(HBsAg、HBcAb、HBeAg和HBeAb均为阴性)。首先采用巢式PCR方法分离HBV阳性血浆中的病毒序列并进行测序;然后,采用体外中和试验的方法分析疫苗免疫后HBsAb阳性血清对不同突变型HBV毒株的中和能力;最后,通过采用Lasergene分析HBV突变株B细胞和T细胞表位的改变情况,并使用Gamier-Robson、Chou-Fasman和Phyre 2等方法预测HBV突变株的二级和三级结构特征。(3)采用SAS 9.4进行数据整理与分析。其中,正态分布的连续性变量采用均数±标准差,两组间中和率的比较用秩和检验,分类变量采用率(%)表示,采用Logistic回归分析细胞表位突变水平与HBsAb抗体中和能力的相关性。所有分析均采用双侧检验,P<0.05为有统计学意义。研究结果(1)在528株ve-HBV中,B型和C型ve-HBV分别有215和313株,结果显示,B 型 ve-HBV 分化于 1997 年(95%CI:1987-2005),C 型 ve-HBV 分化于 1976年(95%CI:1955-2003)。B 型 ve-HBV 比 C 型 ve-HBV 的进化速度快(2.103×10-3 vs 1.083×10-3)。此外,C型ve-HBV的成对距离为0.0291±0.0169,显著高于B型ve-HBV(0.0145±0.0121,t=131.02,P<0.05)。(2)BSP分析结果显示,B型ve-HBV的有效种群规模(EPS)从1996年到2003年总体趋势保持不变,之后逐渐增加直到2007年,然后在2011年大幅减少,之后保持恒定,但是在2016年有再次上升的进化趋势。C型ve-HBV的EPS从1996到2003年迅速增加,之后一直保持平稳,但在2011年和2013年间有个小幅度的下降和上升,之后保持稳定趋势。而所有ve-HBV的EPS与C型相似。从整体来看,C型ve-HBV的种群波动幅度大于B型ve-HBV,两者的EPS都是先上升再保持相对稳定的进化趋势。(3)B型ve-HBV中,有4个位点呈阳性选择(A5T/S、L21S、T/A126S和T/N1311/A),而在基因C型ve-HBV中,有13个阳性选择位点(N3S、T5A、G10Q/R/E、L21S、T47K/A/V、L98V/P、I/S126N/V/T、Q129H/R/L、T131P/I/N/A、G145A/R、L175S/F、L213I/S和V224A/G),提示这些位点的突变具有形成潜在流行的趋势。(4)在579份HBsAg阳性血浆中共扩增出183条HBV/S区全长序列,其中MHR外变异的HBV毒株有95个(51.91%)。其中,B、C型HBV毒株分别有20和75个。在95株HBV序列中,共有276个氨基酸发生突变(1.29%),涉及70个位点(30.97%,70/226),其中突变频率较高的位点是T47A/K(26.32%),其次是M/L213I和Y200F/L/C,对应的突变率依次为22.11%和20.00%。(5)含有B型MHR外变异HBV的样本均可被乙肝疫苗诱导的HBsAb阳性血清所中和,而含有C型MHR外变异HBV的的血浆中有34例不能被乙肝疫苗诱导的HBsAb阳性血清中和(45.33%)。进一步分析发现,C型MHR外变异HBV毒株中,不中和组HBV的B细胞表位aa1-10区域突变率(N3S和A5T突变)是中和组的2.73倍(95%CI:1.06-7.01)。而且,aa1-10区域中N3S或T5A变异不仅使HBsAg的B细胞抗原表位结构发生改变,而且也影响aa1-10的空间构象。(6)2000-2016年间,我国含N3S或T5A变异的所有HBV毒株,EPS在2005年急速上升,之后保持稳定趋势,但在2011年有一个急速的下降而后又反弹,在2015年之后这些毒株有下降趋势。从整体来看,在2000-2016年我国含N3S或T5A变异的HBV呈现上升的进化趋势。研究结论(1)2000-2016年间,我国C型ve-HBV的遗传多样性高于B型ve-HBV,但B型ve-HBV的进化速度比C型ve-HBV的进化速度更快。此外,动态的EPS呈现出HBV基因型的特异性,C型ve-HBV的群体波动幅度大于B型ve-HBV。(2)C型HBV中HBsAg的B细胞表位aa1-10区域N3S或T5A突变能够影响疫苗免疫诱导抗体的中和效能,其机制与aa1-10区域的二级和三级结构发生改变有关。此外,在2000-2016年间,含N3S和T5A突变已形成阳性选择,有效种群规模上升,提示具有形成潜在流行的趋势。