目 的:芪蓟肾康颗粒剂是导师张君教授在三十余年的临床治疗儿童肾脏病的经验上结合古经方化裁而来。本实验研究对象为肾小管上皮细胞,运用转化生长因子β 1诱导肾小管上皮细胞发生间充质转分化,再制取不同组的药理血清并作用于发生间充质转分化的肾小管上皮细胞上。选取24h、48h、72h三个不同的时间点,通过观察TGF-β 1诱导的肾小管上皮细胞FN、ColIV及E-cadherin、α-SMA两种蛋白的表达水平,分别从细胞水平和蛋白水平上探究芪蓟肾康对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞作用机制的影响。材料与方法:1材料1.1实验动物SPF级SD大鼠54只,雌雄各半,(辽宁长生生物技术有限公司)。1.2细胞株HK-2人肾小管上皮细胞株,(广州吉妮欧生物科技有限公司)。1.3实验药品1.3.1芪蓟肾康组:小蓟、白花蛇舌草、仙鹤草、牡丹皮、丹参、黄芪等多位单味药颗粒剂(江阴天江药业有限公司)。1.3.2对照组:替米沙坦片(上海勃林格殷格翰药业有限公司)。1.4.1主要仪器Co2培养(Thermo美国);超净工作台(Thermo美国);台式离心机(Heraeus德国);酶标仪(TECAN瑞士);倒置相差显微镜(Olympus日本);超低温冰箱(SANYO日本);电泳仪(六一仪器厂北京);水平摇床(六一仪器厂北京);垂直电泳槽(六一仪器厂北京)。1.4.2主要试剂RPMI-1640培养液(HyClone公司);PBS:磷酸缓冲液(HyClone公司);转化生长因子β1(美国peprotech公司);小牛血清(HyClone公司);ELISA试剂盒(AMEKO公司);兔抗α-SMA多克隆抗体(Cell Signaling公司);兔抗E-cadherin多克隆抗体(Cell Signaling 公司);HRP 标记抗兔 IgG(Cell Signaling 公司)。2方法2.1细胞培养及传代细胞的培养:人肾小管上皮细胞,先观察其生长状态,生长状态良好后吸弃培养瓶内原培养液,加入新的完全培养液进行培养繁育,每两天更换一次瓶内的培养液。细胞的传代:当细胞覆盖瓶底80%左右,且细胞生长周期为对数时,吸弃瓶内原培养液,再用PBS冲洗两次,然后加入0.25%的胰酶消化,4-5min,置于37℃CO2培养箱内。消化结束后,吸弃上层培养液,反复吹打瓶壁使细胞脱落于培养液中。最后吸出瓶内所有培养液,离心后弃清液,加入新的完全培养液,制成细胞混悬液,均等分加入到多个新培养瓶中,完成细胞的传代。2.2药理血清制备SD大鼠54只,雌雄各半,随机分成6组,每组9只,组别分别为空白组,模型组,替米沙坦组,芪蓟肾康颗粒剂低、中、高剂量组。连续5天行灌胃,末次给药后的1h腹主动脉采血,离心出血请,标记、保存、备用。具体给药方法如下:空白组和模型组使用0.9%的生理盐水灌胃。替米沙坦组等同成人最大量80mg/d;芪蓟肾康低剂组等同人的有效剂量;芪蓟肾康中浓度组等同人的2倍有效剂量;芪蓟肾康高浓度组等同人的4倍有效剂量。2.3细胞活性的检测(MTT法)通过预实验结果而得知含药血清的最佳浓度为15%,TGF-β1的最佳浓度为10ng/mL。在96孔培养板上接种细胞混悬液,分为六组,分别为空白组、模型组、替米沙坦组、芪蓟肾康低、中、高剂量组,n=10。于24h、48h、72h三个时间点测定0D值(565mm)。2.4FN、ColⅣ 的检测(ELISA 法)分别于24h、48h、72h三个时间点对各组的细胞上清液进行收集并标记,用ELISA法检测FN、ColⅣ。严格按照说明书上的操作,24h和72h的n=7,48h的n=8,分组同MTT。再于三个时间点测定0D值,依照标准参数绘制标准曲线。2.5 α-SMA、E-cadherin 的检测(Western Blot 法)收集24h、48h、72h三个时间点的细胞,使用考马斯亮蓝法对各组蛋白浓度进行测定。各样本制成上样液。加压电泳,转膜,封闭,加一抗、二抗,洗膜,发光显色,用Western Blot成像系统采集图像并保存。最后用Image J软件对灰度值进行分析。结 果:1细胞活性检测结果(MTT法)。24h的高剂量组与其他5组相比均具有统计学意义。48h的高剂量组与模型组、芪蓟肾康各剂量组相比均具有统计学意义。72h的芪蓟肾康高剂量组与替米沙坦组相比具有统计学意义。与模型组相比,24h、48h的芪蓟肾康高剂量组均具有统计学意义。与替米沙坦组相比,三个时间点的芪蓟肾康高剂量组均具有统计学意义。2 FN、ColⅣ的检测结果(ELISA法)。2.1 FN 的含量(ELISA 法)。24h、48h、72h三个时间点,模型组与正常组相比、模型组和四组药物组相比均具有统计学意义。48h和72h,替米沙坦组与芪蓟肾康不同剂量组相比均具有统计学意义,24h的替米沙坦组与芪蓟肾康中、高剂量组相比有统计学意义。48h和72h的芪蓟肾康低中高三组均具有统计学意义。三个时间点的芪蓟肾康低剂量组与芪蓟肾康中、高剂量组相比,均具有统计学意义。2.2 ColⅣ 的含量(ELISA 法)。24h、48h、72h三个时间点,模型组与正常组相比、模型组和四组药物组相比均具有统计学意义。24h的替米沙坦组与芪蓟肾康低剂量组相比具有统计学意义,48h、72h的替米沙坦组与芪蓟肾康不同剂量组相比均具有统计学意义。48h和72h的芪蓟肾康各剂量组均具有统计学意义。三个时间的芪蓟肾康低剂量组与芪蓟肾康中、高剂量组相比具有统计学意义。3 E-cadherin、α-SMA 的检测结果(Western Blot 法)。3.1 E-cadherin蛋白印迹分析结果与模型组相比,其余5组均具有统计学意义;与替米沙坦组相比,芪蓟肾康低剂量组具有统计学意义;与芪蓟肾康低剂量组相比,芪蓟肾康中剂量和高剂量组具有统计学意义。3.2 α-SMA蛋白印迹分析结果(Western Blot法)与模型组相比,其余5组均具有统计学意义;与替米沙坦组相比,芪蓟肾康低剂量和高剂量组具有统计学意义;与芪蓟肾康低剂量组相比,芪蓟肾康中剂量和高剂量组的α-SMA表达具有统计学意义。与芪蓟肾康中剂量组相比,芪蓟肾康高剂量组具有统计学意义。结 论:1.本实验证明了 TGF-β 1能够诱导人肾小管上皮细胞发生肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化,而且肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化可增加细胞外基质的产生,从而对肾脏纤维化起推进作用。2.本实验证明了芪蓟肾康颗粒剂能有效的抑制肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化的发生并且减少细胞外基质的产生,而且其抑制作用随着剂量的增加而加强。3.本实验证明了替米沙坦同样能够有效的抑制肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化的发生和减少细胞外基质的产生。