论文部分内容阅读
目的:
原核表达和纯化谷氨酰内切酶和果糖氨基酸氧化酶,研究谷氨酰内切酶的生物化学特性;以重组谷氨酰内切酶和果糖氨基酸氧化酶为基础,建立糖化血红蛋白酶法检测方法并对其初步评价。
方法:
以PQE60GIu△Cmut5质粒转化大肠杆菌M15,经IPTG诱导、Ni-NTA亲和层析等步骤获得重组谷氨酰内切酶;以偶氮酪蛋白为底物测定谷氨酰内切酶活性和米氏常数,分析底物浓度、温度、pH、金属离子和EDTA对酶活性的影响,并用SDS-PAGE电泳和质谱研究其对Hb的水解作用。
以烟曲霉菌总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增出果糖氨基酸氧化酶基因,克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒pET32a(+)/FAOX,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达和Ni-NTA纯化,获得重组果糖氨基酸氧化酶:以糖基化六肽为底物检测重组果糖氨基酸氧化酶活性。
利用谷氨酰内切酶和果糖氨基酸氧化酶的特性,建立糖化血红蛋白酶法检测方法,测定其准确度和精密度,并将其对临床标本的检测结果与实验室己建立的HPLC法和日本爱科来HA-8160型全自动糖化血红蛋白仪检测结果作相关性分析。
结果:
谷氨酰内切酶可以在M15菌中高效表达,纯化后重组蛋白质纯度高,相对分子量为33 kDa,比活性为540.3 U/mg。重组谷氨酰内切酶对偶氮酪蛋白的Km值为0.26 mmol/L,最适反应温度为55℃,最适pH为8.0,Ca2-和Mg2+能激活酶活性,Fe2+、Zn2+、Mn2+和EDTA则对酶活性有抑制作用。SDS-PAGE电泳和质谱显示重组谷氨酰内切酶对血红蛋白有特异性水解作用。
用Trizol试剂提取烟曲霉菌培养后的菌体,获得了烟曲霉菌的总RNA。以cDNA为模板,通过PCR扩增出约1300 bp的果糖氨基酸氧化酶基因。将构建的重组质粒pET32a(+)/TAOX进行酶切鉴定,琼脂糖凝胶电泳可见约1300 bp的目的片段,测序结果显示所含目的基因序列正确。阳性重组质粒经诱导表达后,上清液纯化后进行SDS-PAGE电泳,结果显示重组果糖氨基酸氧化酶的相对分子量约65 kDa。以糖基化六肽为底物,检测其比活性为22 U/mg。
依据酶法检测糖化血红蛋白的原理和谷氨酰内切酶、果糖氨基酸氧化酶的特性,建立了糖化血红蛋白Alc双试剂测定方法。该法对临床高值、低值标本的CV值分别为1.05%和0.89%;对Bio-Rad公司质控品的实测值在可接受范围之内。与HPLC法进行比较,其回归方程为Y=0.9772X-0.3432(r=0.9845);与HA-8160型全自动糖化血红蛋白仪测定结果也有良好的相关性,回归方程为Y=0.9853X-0.5604((r=0.9932)。
结论:
谷氨酰内切酶和果糖氨基酸氧化酶可以分别在大肠杆菌M15和Rosetta(DE3)中获得高效表达。纯化后的重组蛋白质具有较高的生物活性,并可以用于糖化血红蛋白Alc的测定。建立的糖化血红蛋白酶学测定法具有准确度高、精密度好等优点。