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肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)具有独特的生物学功能和结构特异性。它还在人体免疫系统,肿瘤发生和细胞转移中发挥重要作用。TRAF6不仅调节TNFR超家族的细胞内信号转导,而且介导IL-1/TLR超家族信号转导。TRAF6的RING结构域具有E3连接酶活性,能够导致AKT和TAK1两者的活化并促进细胞存活,同时TRAF6的ZINC结构为RING结构域的活性提供了重要的结构支持。另一方面,TRAF6的C末端结构域已被证明主要参与免疫信号转导,并且在调节先天免疫,适应性免疫,应激反应和炎症反应方面至关重要。因此,筛选可与TRAF6特异性相互作用的小分子化合物有助于发现不影响TRAF6的免疫功能的新型抗癌靶标。在这项研究中,选择TRAF6的RING结构域作为开发新的化学治疗剂的作用靶点并且通过体内和体外实验探究其抗肿瘤活性。通过计算机辅助的虚拟筛选,我们发现了天然存在的金鸡纳生物碱可以与Ubc13竞争性结合TRAF6的RING结构域。MTT实验检测发现这些天然产物能够抑制肿瘤细胞的增殖,并且流式细胞术进一步证明它们可以诱导肿瘤细胞的早期凋亡。Western blot和免疫沉淀实验检测TRAF6介导的信号通路,验证这些化合物能抑制AKT和TAK1的激活,进而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达同时促进促凋亡蛋白Bax的表达。此外,动物实验表明,在体内化合物刺激的小鼠的肿瘤增殖率显着低于未刺激组。TUNEL染色结果显示,化合物刺激组的TUNEL阳性细胞多于未刺激组。同时,通过T淋巴细胞亚群和细胞因子的检测分析,我们发现金鸡纳碱化合物可以促进TNF-α,IFN-γ和IgG的分泌,并且不会对CD4~+T/CD8~+T的比值产生明显的影响,从而说明了金鸡纳碱化合物在诱导肿瘤细胞凋亡的同时不影响TRAF6的C末端结构域,反而增强抗肿瘤免疫性。最后,我们选择金鸡纳碱代表化合物辛可宁,设计合成了一种荧光标记的辛可宁和阻滞活性羟基的辛可宁衍生物。此外,我们还构建了低表达TRAF6的细胞系。免疫荧光实验显示荧光标记的辛可宁可以与细胞中的TRAF6结合,从而验证辛可宁自身与TRAF6的结合。MTT实验结果表明,阻滞羟基活性的辛可宁对细胞增殖的影响明显低于正常辛可宁。最后,低表达TRAF6水平的细胞对这些生物碱的敏感性明显低于正常细胞。这些研究共同表明,天然存在的金鸡纳生物碱可以阻断TRAF6与Ubc13的结合来抑制肿瘤细胞的生长并且对与TRAF6的C端结构域的活性有关的免疫应答具有最小的影响。研究阐明了TRAF6的RING-Zn结构域作为抗肿瘤靶点的可能性,为抗癌新药研发提供坚实的理论基础,为肿瘤的靶向治疗开辟新途径。