背景及目的:阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(Obstructive Sleep Apnea Hypopnea Syndrom,OSAHS)是临床上常见的一种睡眠呼吸障碍性疾病,是指在夜间睡眠过程中反复发生的上气道完全或不完全阻塞,导致频繁的呼吸暂停和(或)低通气。而慢性间歇低氧(Chronic Intermittent Hypoxia,CIH)是OSAHS最主要的生理特征之一,CIH可诱发糖尿病(DiabetesMellitus,DM)的发生,尤其是2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM),是影响OSAHS患者的危险因素之一。很多研究己发现,OSAHS常与DM共存。而氧化应激是OSAHS和T2DM发生发展过程中的共同病理生理过程。OSAHS通过氧化应激作用机制诱发胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)、高胰岛素血症、糖脂代谢紊乱和DM,若氧化应激反应未被抑制,则可进一步使得DM并发症发展甚至恶化;而DM患者糖代谢异常、糖脂代谢紊乱又会加重氧化应激,进而出现恶性循环。因此,我们要高度重视糖尿病患者睡眠呼吸暂停低通气的早期诊断,早期预防及干预治疗,从而改善机体长期间歇低氧状态。而大蒜(Garlic)作为百合科葱属植物大蒜(Allium sativum L.)的地下鳞茎,既是大家喜爱的调味品,又是常用的植物药,是一种药食同源的植物。现代实验研究证明大蒜及其提取物具有多种药理活性,如降血糖、降血压、降血脂、清热解毒、杀菌消炎、抗血栓、抗肿瘤、提高机体免疫力和医疗保健作用等,而且很多研究发现大蒜及其提取物大蒜素能够有效改善抗氧化酶活性、提高机体对氧自由基的清除能力以及抑制机体免受氧化应激损伤等。然而,目前没有关于大蒜素针对慢性间歇低氧糖尿病治疗方面的相关研究。本研究就大蒜素对CIH、DM以及CIH-DM诱导的小鼠进行干预治疗,观察小鼠的体重、血糖、血清胰岛素水平、胰岛素抵抗指数、氧化酶、抗氧化酶活性、脂质代谢以及相关酶等的变化,以此来明确大蒜素对CIH、DM以及CIH-DM小鼠胰岛β细胞、氧化应激的影响以及对器官的保护作用,为临床上预防与治疗OSAHS合并DM患者提供一定的实验参考。研究方法:各实验组小鼠模型建立32只小鼠被平分为8组,每4只为一组,分别为:1、对照(C)组小鼠模型建立:小鼠没有被特殊处置,在实验期间仍然继续放置在无特殊病原体环境中,供给标准的食物和饮用水。2、慢性间歇低氧(CIH)组小鼠模型建立:每天供给小鼠标准的食物和饮用水,同时暴露在低压低氧室内,每5分钟一次90秒低氧(5%氧浓度)和210秒常氧(21%氧浓度)循环,在光照期间每天8小时低压低氧环境,共持续6周。实验在上午9点到下午5点之间进行。3、糖尿病(DM)组小鼠模型建立:实验开始时,给正常小鼠注射单剂量链脲霉素(Streptozotocin,STZ,50 mg/kg)。日常喂食高脂饮食。注射STZ 一周后,使用血糖仪检测末梢静脉血血糖水平。如果血糖水平超出250mg/dl,则认定糖尿病小鼠诱导成功,而非糖尿病小鼠则被剔除出实验。在每一组中至少保证有3只小鼠纳入实验研究。4、慢性间歇低氧-糖尿病(CIH-DM)组小鼠模型建立:小鼠使用与DM组相同的实验方法。一周后,糖尿病小鼠诱导成功后,接着暴露在与CIH相同的低压低氧环境中6周。5、对照-大蒜素(C-G)组小鼠模型,,其建立过程为:小鼠在整个实验期间,是在无特定病原环境中喂食标准的食物及饮用水,同时每日于小鼠腹腔内一次性注射500mg/kg大蒜素,共7周。6、慢性间歇低氧-大蒜素(CIH-G)组小鼠模型建立:每日于小鼠腹腔内一次性注射500mg/kg大蒜素(共7周),实验开始时进入与CIH组相同的实验程序中。7、糖尿病-大蒜素(DM-G)组小鼠模型,建立过程为:每日于小鼠腹腔内一次性注射500mg/kg大蒜素(共7周),实验开始时进入与DM组相同的实验程序中。8、慢性间歇低氧-糖尿病-大蒜素(CIH-DM-G)组小鼠模型建立:每日于小鼠腹腔内一次性注射500mg/kg大蒜素(共7周),实验开始时进入与DM组相同的实验程序中。一周后,糖尿病小鼠诱导成功后,接着暴露在与CIH相同的低压低氧环境中6周。本研究共分三个部分。第一部分大蒜素对慢性间歇低氧糖尿病小鼠胰岛β细胞功能的影响目的:主要研究大蒜素对慢性间歇低氧糖尿病小鼠血糖、血清胰岛素、稳态模型的胰岛素抵抗指数(Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance,HOMA-IR)的作用,明确大蒜素对慢性间歇低氧糖尿病小鼠胰岛β细胞功能的影响。方法:分别测定各实验组实验前(0天),以及实验开始后每周(7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天)小鼠的体重、血糖、胰岛素水平并计算上述各实验组各实验期间的HOMA-IR。结果:在C组,小鼠的体重逐渐增加,而在CIH、DM以及CIH-DM组中,小鼠的体重相对较健康对照组生长缓慢(P值均<0.05)。在DM以及CIH-DM组中血糖升高,而胰岛素水平在CIH组中升高明显,但在DM以及CIH-DM组中胰岛素水平下降,从而导致CIH小鼠较高的HOMA-IR(P值均<0.05)。大蒜素治疗改善DM-G和CIH-DM-G组小鼠体重增长、血清胰岛素以及HOMA-IR,同时在DM-G以及CIH-DM-G组血糖下降,在CIH-G组血清胰岛素和HOMA-IR降低(P值均<0.05)。结论:①CIH、DM和CIH-DM是影响鼠体重增长的重要因素,大蒜素治疗可以提高DM-G以及CIH-DM-G小鼠的体重,特别是由DM诱导的小鼠经大蒜素处理后,其体重增长更明显;②DM或CIH-DM小鼠血糖异常升高,大蒜素可降低DM-G和CIH-DM-G小鼠的血糖,但血糖在实验结束时仍然不能恢复到正常水平;③CIH增加小鼠血清胰岛素,DM或CIH-DM会减少小鼠胰岛素水平。而大蒜素使得CIH-G小鼠血清胰岛素下降,DM-G、CIH-DM-G胰岛素水平升高;④由CIH诱导的小鼠存在更明显的胰岛素抵抗,而大蒜素治疗可以明显改善CIH-G、DM-G或CIH-DM-G组小鼠的胰岛素抵抗程度。第二部分大蒜素对慢性间歇低氧糖尿病小鼠全身性氧化应激及脏器功能的影响目的:本部分内容是应用大蒜素处理慢性间歇低氧糖尿病小鼠,进一步监测小鼠血清学相关指标,包括氧化酶、抗氧化酶活性,蛋白脂质、血清肝脏转氨酶,以及尿液中尿蛋白含量等,旨在研究大蒜素对慢性间歇低氧糖尿病小鼠机体氧化应激及脏器功能的影响,为预防与治疗提供实验参考。方法:实验结束后,留取各实验组小鼠血液及24小时尿液,分别测定硫代巴比妥酸反应物(Thiobarbituric Acid Reactive Substances,TBARS)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)、超氧化物歧化物(Superoxide Dismutase,SOD)、谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione S-Transferase,GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-Px)、谷胱甘肽还原酶(Glutathione Reductase,GR)、尿酸(Uric Acid,UA)、白蛋白(Albumin,ALB)、总脂质(Total Lipids,TL)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatases,ALP)、酸性磷酸酶(Acid Phosphatases,ACP)、总胆固醇(Total Cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglycerides,TG),以及尿蛋白(Urine Protein,UP)。结果:在 CIH、DM 以及 CIH-DM 组中,血清 TBARS、GST、UA、TC、TG、TL、AST、ALT、LDH、ALP、ACP,尿 UP 水平升高,而血清 SOD 以及DM、CIH-DM组小鼠ALB水平下降(P值均<0.05)。在DM、CIH-DM组中,NO水平升高,而在CIH组下降(P值均<0.05)。GSH-Px在CIH组升高,而在DM、CIH-DM组下降(P值均<0.05)。GR水平在DM组中升高,在CIH以及CIH-DM组中下降(P值均<0.05)。大蒜素治疗使得CIH-G、DM-G以及CIH-DM-G组血清SOD水平升高,同时在DM-G和CIH-DM-G组,GSH-Px和白蛋白增加,而在CIH-G、DM-G和CIH-DM-G组,血清TBARS、UA、TC、TG、TL、AST、ALT、LDH、ACP,尿UP水平下降,同时下降的还有DM-G组 NO,CIH-G、CIH-DM-G 组 GST,DM-G 组 GR,以及 DM-G 和 CIH-DM-G组的ALP(P值均<0.05)。结论:①CIH、DM以及CIH-DM均会引起小鼠血清脂质过氧化物TBARS升高,以及血清转氨酶、尿酸、血脂、尿蛋白等水平的升高,而大蒜素治疗组,其含量均显著下降;②CIH、DM以及CIH-DM组小鼠血清中抗氧化酶GSH-Px、GR、SOD含量普遍下降,而大蒜素可以有效改善其活性。第三部分大蒜素对慢性间歇低氧糖尿病小鼠脏器氧化应激的影响以及对器官功能的保护作用目的:本部分内容是通过大蒜素对CIH、DM、CIH-DM各组实验小鼠进行干预,测定肝脏、肾脏以及脑组织内转氨酶、相关氧化酶及抗氧化剂活性,以此来评估大蒜素对CIH、DM、CIH-DM相关脏器氧化应激的影响以及对器官的保护作用,从而为临床上OSAHS、糖尿病的相关合并症、并发症的预防与治疗提供实验依据及实验参考。方法:实验结束后,严格遵守实验室动物护理和使用指南,戊巴比妥钠麻醉所有小鼠,采集血样、尿液后立即分离肝脏、肾脏、脑组织,并称重。分别清洗、分离、切碎、研磨、混匀、离心各分离组织,制备各分离组织上清液用于酶的测定。分别测定肝脏 TBARS、GST、GSH-Px、AST、ALT、LDH、ALP、ACP、过氧化氢酶活性(Catalase activity,CAT)、SOD水平;测定肾脏TBARS、GST、CAT、SOD;测定脑组织 TBARS、GST、LDH 水平。结果:在CIH、DM、CIH-DM组,肝脏TBARS、GST浓度增加,而AST、ALT、LDH、ALP、ACP、CAT、SOD 下降,肝脏 GSH-Px 在 DM 以及 CIH-DM组下降(P值均<0.05)。在DM、CIH-DM组中肾脏TBARS水平增加,在CIH、DM、CIH-DM组中,肾脏GST水平升高,而CAT、SOD下降(P值均<0.05)。在CIH、DM、CIH-DM组脑TBARS水平增加,以及脑LDH水平在DM以及CIH-DM组中升高,而脑LDH在CIH组下降(P值均<0.05)。与非大蒜素组比较,CIH-G、DM-G 和 CIH-DM-G 组肝脏 AST、ALT、LDH、ALP、CAT、SOD水平升高,CIH-G、DM-G 组 ACP,DM-G、CIH-DM-G 组 GSH-Px,CIH-DM-G组肾脏CAT,CIH-G和CIH-DM-G组肾脏SOD水平均明显升高,而CIH-G、DM-G以及CIH-DM-G组的肝脏、脑TBARS水平下降,DM-G、CIH-DM-G组肝脏和肾脏GST,脑LDH水平降低(P值均<0.05)。结论:①CIM、DM以及CIH-DM均可引起器官脂质过氧化物升高,而大蒜素治疗组,其含量均较非大蒜素组低。②CIH、DM以及CIH-DM组小鼠器官中抗氧化酶GSH-Px、GR、SOD、CAT含量普遍下降,而大蒜素组抗氧化酶均较非大蒜素组提高。全文总结:本研究成功的运用大蒜素治疗CIH、DM或CIH-DM小鼠,通过研究分析,CIH、DM以及CIH-DM会引起小鼠胰岛β细胞功能紊乱、胰岛素抵抗,导致血糖异常,同时可诱导小鼠肝细胞损害、脂质代谢紊乱、肾脏损害、脑功能代谢障碍等,而大蒜素具有改善抗氧化酶活性,清除超氧化物阴离子,抑制机体氧化应激损伤的能力,在保护器官损害、代谢紊乱方面有调节作用。因此该研究认为,大蒜素同时具有抗氧化、解毒和保护细胞、器官免受损害,同时发现大蒜素可有效调节及改善CIH、DM或CIH-DM小鼠的体重、血糖、胰岛素、胰岛素抵抗和脂质代谢的失衡。通过分析认为大蒜素在治疗CIH、DM或CIH-DM方面有显著的效果,并能一定程度上预防CIH、DM或CIH-DM等疾病的发生、发展。