1研究背景与研究目的肾母细胞瘤是小儿泌尿系统最常见的恶性实体肿瘤。肾母细胞瘤是原发性肾脏恶性肿瘤,由于一些原始的肾胚胎细胞在发生的进程中出现了基因调控的异常,进而使细胞分化成熟出现障碍,导致了细胞异常增殖分裂而不受控制。在肾母细胞瘤细胞中,经常可以看到原始的肾小管和肾小球。大约75%的病例发生在5岁以内的儿童,尤其多见于2~4岁的幼儿。肾母细胞瘤约93%为单侧发病,大约10%的患儿为双侧发病,左右两侧的发病率大致相近,同时或者相继发生。发病率在男女性别上几乎没有差异,但是在大部分的病例报告中,男性患者发病率稍多于女性,也有极少病例发生于成人。肾母细胞瘤瘤体体积比较大,边界分布清楚,部分肿瘤也可有假膜形成。肾母细胞瘤的切面颜色灰白,切面多呈烂鱼肉样,肿瘤质地比较柔软,大部分伴有出血和坏死等,也可见骨样组织的出现。目前早期诊断、病理分型以及恰当的治疗方式是影响患儿预后的主要因素。目前,肾母细胞瘤的诊断主要依据患儿的临床表现结合超声,静脉尿路照影,CT等手段。对于肾母细胞瘤I或II期的患儿,主要还是以手术治疗或化疗为主;而对于晚期病例则需要扩大治疗,辅以化疗,甚至放疗。多数病例虽然得以确诊,却因不能早期诊断,贻误最佳治疗时机而影响预后。目前,随着蛋白质组学技术的日趋成熟,为恶性肿瘤的相关研究提供了新的思路。如今应用最广泛的蛋白组学技术是表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术,蛋白质芯片的应用是其核心技术,它的主要特点就是可以从生物和临床样品中快速提供蛋白质表达谱的能力。肿瘤标志物既能够作为患者早期诊断的有力证据,又能够作为后期疗效的监测指标。在本课题组前期的研究过程中,我们已经通过蛋白质组学技术筛选和鉴定了肾母细胞瘤血清中的肿瘤标志物,但是,肾母细胞瘤瘤体组织中是否存在与血清中类似的蛋白质标记物尚不清楚。另外,在肿瘤的发生和发展的各个阶段,炎症也起到一定的推动作用,在肿瘤患者的血清中,可以检测到某些炎症因子的参与,其可能干扰肿瘤的诊断和监测。所以,在筛选和鉴定肿瘤标志物过程中,有必要剔除炎症因子的干扰。另外仅仅排除和肿瘤相关的炎症因子也不足以排除炎症因子的干扰,本研究选取SIRS患儿血清作为对照组,扩大剔除的炎症因子范围。全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS):是因为机体受到感染或非感染的病因,导致机体自我持续放大和自我破坏的而失控的全身性炎症反应。全身炎症反应综合征是机体在修复和生存的过程中出现过度的应激反应的一种临床过程。与此同时,机体和组织会释放大量的炎性介质和细胞因子,在病人的血液循环中早期可以发现如IL-1,TNF,MIP;接着会发现许多细胞因子,中性细胞脱颗粒物,补体片段,花生四烯酸衍生物,还有多种趋化因子。本研究运用蛋白质组学的表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术检测肾母细胞瘤患儿血清,健康对照组血清,同时与重症感染患儿对照组血清进行对比,最大程度剔除炎症因子的干扰,筛选出特异的蛋白质标记物,运用高效液相色谱技术(HPLC)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)对目标蛋白进行纯化,并用二维液相色谱-线性离子阱质谱(2D-LC-LTQ-MS)联用系统技术对筛选出的特异的蛋白质标记物进行鉴定,以期与前期的研究结果相契合。同时,为了验证在肾母细胞瘤瘤体组织中是否存在相似的非炎症性蛋白质标记物,本研究通过表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术检测肾母细胞瘤患儿瘤体组织总蛋白,正常肾组织总蛋白,同时与重症感染患儿对照组血清进行对比,剔除炎症因子的干扰,筛选出特异的蛋白质标记物,运用聚丙烯酰胺凝胶电泳(TRICINESDS-PAGE)技术对目标蛋白进行纯化,收集目标蛋白。利用基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)技术鉴定目标蛋白。所以,本研究的目的就是最大程度排除炎症因子的干扰,筛选和鉴定肾母细胞瘤血清及其瘤体组织中特异性蛋白质标记物。2 材料与方法2.1 实验材料2.1.1临床病例资料本研究收集170例血清和85例组织标本均从郑州大学第一附属医院获得。其中肾母细胞瘤组血清50例,平均年龄2.9±0.1岁,男性28例,女性22例;正常对照组血清60例,平均年龄3.2±0.1岁,男性34例,女性26例;SIRS对照组60例,平均年龄3.1±0.1岁,男性37例,女性23例。外周静脉血标本均抽取于患儿清晨空腹时,室温下静置1h,3000r/min离心10min,收集血清样本,储存于-80℃冰箱,保存备用。收集郑州大学第一附属医院2011年至2013年肾母细胞瘤患儿术后瘤体组织45例,其中男性23例,女性22例,平均年龄2.8±0.1岁。收集患儿癌旁正常肾组织40例(根治性手术31例,姑息性切除9例)作为正常对照组,男性22例,女性18例,平均年龄2.9±0.1岁。正常对照组,SIRS对照组与肾母细胞瘤组年龄、性别相匹配。相关结果得到2位以上的病理学专家证实经手术及组织穿刺活检病理诊断为肾母细胞瘤。收集的组织样本,储存于-80℃冰箱,保存备用。本实验经伦理委员会同意,且受试者均签署有知情同意书。2.1.2主要试剂及仪器尿素、Na AC、芥子酸(SPA)、二硫苏糖醇(DTT)、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)和胰蛋白酶均来自美国Promega公司。SELDI-TOF-MS、Ciphergen PBS II和WCX2蛋白质芯片均来自美国Ciphergen公司。胰岛素、细胞色素C、碘乙酰胺(IAM)、乙腈、α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、NH4HCO均来自美国Sigma公司。RNeasy Plus Micro Kit试剂盒、RNAprep pure Tissue Kit购自北京Qiagen公司。PBS II+型SELDI-TOF-MS和Bio-processor:弱阳离子交换芯片(WCX2)蛋白质芯片工作平台均来自于美国Ciphergen Biosystem公司;HPLC来自于日本Shimadzu公司,其中C18(250*4.6mm)色谱柱来自于德国Sunchrom公司;MALDI-TOF/TOF-MS系统来自于德国Bio Rad公司;2D-LC-LTQ-MS系统来自于美国Thermo Electron公司。2.2实验方法 2.2.1组织总蛋白的提取以下操作均在冰上进行:1.将低温保存的组织样本进行称重。2.加入细胞裂2材料与方法 2.1实验材料解液。组织样本与细胞裂解液比例一般为100mg:500μl,然后加入蛋白酶抑制剂2ul。3.用组织匀浆器把肿瘤组织匀浆,至无明显肉眼可见固体。4.将组织匀浆吸入另外一个预冷的干净离心管内,4℃14000g/min离心25~30mins。5.最后将上清液转移到另一预冷的干净离心管,即可得到总蛋白。上述蛋白提取物分装后,标记清楚于-80℃冰箱保存备用。2.2.2肾母细胞瘤血清及其瘤体组织中蛋白质的筛选冰浴中解冻血清和瘤体组织总蛋白标本,在4℃下10000r/min离心2min。将96孔板放置于冰盒上,然后,每孔加入5μl血清和瘤体组织总蛋白样本,U9(9mol/L尿素),1%Bar,2%CHAPS10μl,在4℃层析柜中600r/min振荡30min。在震荡结束前留15 min进行蛋白质芯片的预处理,将蛋白质芯片装入Bioprocessor加样器中,记录下蛋白质芯片的号码,每孔加入Na AC(100mmol/L,p H4)200μl,放入层析柜中600r/min振荡2min,重复以上操作1次。经过U9处理后的96孔板置于冰盒上,用排枪加入Na AC185μl,层析柜中4℃600r/min震荡2min。取已处理的样本100μl加到蛋白质芯片上,置于层析柜中4℃600r/min结合1h,甩去残液,快速拍干。然后加入Na AC200μl,600r/min振荡5min后,甩去残液,快速拍干,重复操作3次。接着用去离子水200μl冲洗各孔2次,甩干残液。待蛋白质芯片风干后,每孔加入50%饱和的SPA 1μl,分两次完成,干燥后即可上机待检测。2.2.3数据分析及统计学处理质谱分析的原始数据先经过滤噪音和聚类分析处理,将初步筛选出的质荷比峰值数据做Wilconxon秩和检验。初步筛选出的m/z峰值是分析数据的对像,随后,需要将不同组别间的质谱检测数据进行t检验。检验标准取α=0.01;肾母细胞瘤术前血清组、正常对照组血清、瘤体组织组、正常肾组织组及SIRS对照组血清间的差异性峰值进行分析比对,找出两组差异性蛋白峰值相同的差异性蛋白(数据结果存在0.3%偏差),即聚类分析。其既与正常对照组存在特异性,又与炎性对照组存在特异性,再提出与15种与肿瘤相关的炎性因子,这样就在最大程度上排除了炎症因子对于筛选肾母细胞瘤特异性蛋白质标记物的干扰。2.2.4肾母细胞瘤血清非炎症性标记物的纯化在实验前取出冻存于-80℃冰箱中的分装的血清样品,放置于冰盒上慢慢解冻。吸取血清样品100μl,加入去离子水300μl和乙腈600μl,充分振荡混匀后,放置于4℃下,以便使血清中的大分子蛋白得到充分沉淀。等待30min后取出样品,在4℃的环境中,在10000rpm的转速下离心30min。丢弃沉淀,收集上清液,将液体真空干燥浓缩至体积小于50μl,然后加入H2O/0.1%TFA450μl,充分振荡混匀后,用自行装填的C18固相萃取小柱对其进行脱盐。采用C18反相高压液相色谱柱对经上述处理后的血清样品进行分离。H2O/0.1%TFA为流动相A,ACN/0.09%TFA为流动相B。加注样品前,先用流动相B对色谱柱进行活化15min,再用流动相A对柱体平衡30min,然后通过自动进样器上样。洗脱步骤为:100%流动相A和20-40%流动相B梯度各15min,40-70%流动相B梯度为50min,用100%流动相B冲洗柱体10min。整个过程中流速设置为0.5 ml/min,检测波长设置为214nm、254nm和280nm。用离心管分别收集各峰组分,记录好时间和顺序,将收集样品真空浓缩至体积小于20μl。对初步分离后的血清样品和HPLC分离所得各组分进行MALDI-TOF-MS的线性模式检测。2.2.5肾母细胞瘤瘤体组织非炎症性蛋白标记物的纯化选取0.75mm的制胶玻璃,使下端边缘对齐,用配套的玻璃夹夹紧,然后放置胶架上,将玻璃的下端与胶垫充分接触,防止加入的制胶液体发生泄漏。先配制的分离胶加入至玻璃的2/3,再加入异丙醇使液面水平,静置约1.0h-1.5h,待其凝固后吸干异丙醇,再加入配制的浓缩胶,选用配套的梳子小心插入,防止气泡产生,再次静置大约1.0h,等待胶体凝固,然后放入电泳槽,加入配制的电泳液,小心拔出梳子,准备加入样品。把前期去除大分子蛋白并浓缩后的组织总蛋白质样本加入指示剂5ul,在沸水中煮沸样品10min,取出后再次5000r/min离心5min。取10ul上清液小心加至胶体梳子的齿槽中,第一泳道加入Marker,对应相应的蛋白质分子量,作为观察标尺,后面的泳道依次加入蛋白质样本,且应详细记录。然后连接电泳仪,准确正负极。在浓缩胶时,电压设定为30v,当指示剂接近至浓缩胶与分离胶交界处时,将电压调到90v。大约5h小时后,指示剂接近分离胶胶体底部时,关掉电泳仪,取出玻璃,小心分离浓缩胶和分离胶,防止破裂,把浓缩胶小心切除。然后,小心分离分离胶,放置到清洁的托盘中,倒入考马斯亮蓝染色剂,震荡过夜,进行染色。染色结束后,用去离子水清洗干净,再加入脱色液,震荡4-6小时进行脱色,等待胶体颜色完全脱净后,再用去离子水清洗干净,最后在胶体上显示出目标蓝色条带。将胶体放置超净工作台,带上无菌口罩、帽子及手套,小心切下目标蛋白质目标条带,并将条带切碎,分装至不同EP管,做好标记,分别记录具体蛋白质条带信息,整个过程务必保证在冰面上进行。然后对显示的目标条带进行MALDI-TOF-MS检测,最终确定胶体上目标条带。2.2.6肾母细胞瘤血清非炎症性蛋白标记物的鉴定取对应的目标蛋白质样品20μl,然后加入60μl 8M尿素,使其最终浓度为6M,室温振荡20min使其充分溶解;再加入0.8μl 1M DTT,使其最终浓度为10m M,室温放置1h;然后加入3.2μl 1M IAM,使其最终浓度为40m M,避光放置45min;再加入3.2μl 1M DTT,使其最终浓度为40m M,室温放置30min;最后加入400μl 50m M NH4HCO3以稀释样品,将尿素最终浓度降到1M,p H值控制到大约为8.0。每份样品中加入胰酶0.08μg,于37℃水浴下酶解过夜,然后加入0.2%TFA溶液,使样品溶液p H值下降至6.0以下,以终止样品酶解反应。然后以12000g离心样品溶液10min,吸取上清液,使其真空浓缩至体积小于10μl,再将样品加入到C18蛋白质样品检测的梯度洗脱柱中。将2D-LC-LTQ-MS系统的喷雾系统与加样后的样品柱和梯度洗脱柱相串联,进行肽质荷比图谱的检测。最后,将检测结果录入SEQUEST检索程序,在Bioworks数据库检索与检测结果肽段及氨基酸相匹配的可能蛋白质。2.2.7肾母细胞瘤瘤体组织非炎症性蛋白标记物的鉴定在对应EP管中加入wash buffer80ul,37℃震荡蛋白质样品20min,吸取洗脱液,加入新的wash buffer,重复操作三次,直到胶体的蓝色洗去,接近白色透明状。然后将胶体放入振荡器,温度升至90℃,胶体干燥15min。然后加入Digest Buffer20ul和稀释的Reducing agent2 ul,将其充分混匀。然后,37℃水浴10 min。离开水浴后,使其温度自然降至室温,加入Blocking agent2ul,充分混匀。在室温中静置10min。然后加入稀释的胰蛋白酶0.5ul,充分混匀,使最终胰蛋白酶的浓度达到8ng/ul。务必确保使胶体完全沉浸在液体中,5000r/min离心5min。37℃振荡12-14h过夜。最后,放入离心机,10000r/min离心10-15min,小心将上清液移至新的EP管中,同时在管壁上做好标记,书面记录。在蛋白芯片板靶环上加入1ul酶解样本,室温干燥后加入1ul基质,先对MALDI-TOF/TOF经过校正后,然后经激光解吸电离,收集到相应的肽段质谱数据,通过Mascot搜索软件,再与Swissprot数据库连接,搜索相匹配的蛋白质。2.2.8 RT-PCR验证肾母细胞瘤瘤体组织非炎症性蛋白标记物在组织中的基因表达使用RNAprep pure Tissue Kit提取肿瘤组和正常组组织中的RNA,使用Revert Aid First Strand c DNA Synthesis Kit以RNA为模板合成first-strand c DNA。在Real-time PCR过程中使用Scientific Maxima SYBR Green q PCR Master Mixes检测肿瘤组和正常组的first-strand c DNA扩增情况,分析目标蛋白质的表达。PCR过程中目标蛋白Profilin-1的引物:Forward 5′-ACGCCTACATCGACAACCTC-3′;Reverse 5′-TGATGTTGACGAACGTTTTCC-3′。PCR过程中目标蛋白Ubiquitin的引物:Forward 5’-GTCACTAAGCCATCGGTCGT-3’;Reverse 5’-ACACGGACA CAACCAGTTCA-3’。PCR反应使用两步法:50℃UDG预处理2min,95℃预变性10min;扩增40个循环,每个循环的组成为95℃变性15sec、60℃引物退火30sec、72℃引物延伸30sec。使用Molecular Analyst software软件分析PCR聚合物,使用标准化计算目标蛋白基因对于β-actin的比值。2.2.9 ELISA验证肾母细胞瘤血清非炎症性蛋白标记物在血清中的表达使用Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay(ELISA)检测肿瘤组血清和正常组血清中的APOC-I蛋白质表达情况。首先配制0pg/ml,62.5pg/ml,125pg/ml,250pg/ml,500pg/ml,1000pg/ml,2000pg/ml和4000 pg/ml的APOC-I冻干标准品各100μL,然后加入预包被抗人APOC-I抗体的96孔板中,设置3个复孔;肿瘤组血清和正常组血清蛋白样品各取10个,稀释100倍后,每孔按100μL加入预包被抗人APOC-I抗体的96孔板中,设置3个复孔,孵育酶标板。吸去各孔液体后,加入100μL生物素标记的抗人APOC-I抗体,孵育酶标板;洗板后,加入ABC工作液,孵育酶标板;洗板后,每孔加入TMB显色液90μL,孵育后每孔加入TMB终止液100μL终止显色反应。酶标仪调整到450nm,读出各孔吸光值,根据标准品的吸光值绘制出标准曲线,计算待测样品的浓度。2.2.10 ELISA验证肾母细胞瘤体组织非炎症性蛋白标记物在组织中的表达使用Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay(ELISA)检测肿瘤组和正常组组织中的Ubiquitin和Profilin-1蛋白质表达情况。首先配制0pg/ml,62.5pg/ml,125pg/ml,250pg/ml,500pg/ml,1000pg/ml,2000pg/ml和4000 pg/ml的Ubiquitin和Profilin-1冻干标准品各100μL加入预包被抗人Ubiquitin和Profilin-1抗体的96孔板中,设置3个复孔;肿瘤组和正常组组织总蛋白样品各取10个,稀释100倍后,每孔按100μL加入预包被抗人Ubiquitin和Profilin-1抗体的96孔板中,设置3个复孔,孵育酶标板。吸去各孔液体后,加入100μL生物素标记的抗人Ubiquitin和Profilin-1抗体,孵育酶标板;洗板后,加入ABC工作液,孵育酶标板;洗板后,每孔加入TMB显色液90μL,孵育后每孔加入TMB终止液100μL终止显色反应。酶标仪调整到450nm,读出各孔吸光值,根据标准品的吸光值绘制出标准曲线,计算待测样品的浓度。3结果 3.1肾母细胞瘤血清标记物的筛选通过SELDI-TOF-MS对预处理的肾母细胞瘤患儿血清、健康对照组血清和重症感染患儿血清检测后,得到一系列蛋白质峰值数据和炎症因子峰值及其分解的肽段峰值。这些蛋白质峰值数据按照病例组、正常对照组及炎症对照组进行Wilcoxon秩和检验(P<0.01),将差异性蛋白质峰值筛选出来。其中:病例组血清与正常对照组血清中筛选出37个差异性蛋白质峰值,35个蛋白质峰值在正常对照组中高表达,2个蛋白质峰值在病例组中高表达;病例组血清与炎症对照组血清中筛选出27个差异性蛋白质峰值。将以上两组差异性蛋白进行对比,找出两组差异性蛋白峰值相同的差异性蛋白(数据结果存在0.3%偏差),筛出m/z位于6438Da的蛋白质或肽段。其既与正常对照组存在特异性,又与炎性对照组存在特异性,再提出与15种与肿瘤相关的炎性因子,在最大程度上排除了炎症因子对筛选肾母细胞瘤特异性蛋白质标记物的干扰,确定了肾母细胞瘤非炎症性蛋白质标记物的m/z为6438Da。3.2肾母细胞瘤瘤体组织标记物的筛选通过SELDI-TOF-MS预处理的肾母细胞瘤肿瘤组组织蛋白、正常对照组蛋白检测后,得到一系列蛋白质峰值数据及其分解的肽段峰值。这些蛋白质峰值数据按照肿瘤组、正常对照组进行Wilcoxon秩和检验(P<0.01),将差异性蛋白质峰值筛选出来。其中,肿瘤组与正常对照组中筛选出50个差异性蛋白质峰值,21个蛋白质峰值在正常对照组中高表达,29个蛋白质峰值在肿瘤组中高表达;肿瘤组组与炎症对照组中筛选出50个差异性蛋白质峰值。将以上两组差异性蛋白进行对比,找出两组差异性蛋白峰值相同的差异性蛋白(数据结果存在0.3%偏差),筛出m/z位于8350Da和5363Da的蛋白质或肽段。其既与正常对照组存在特异性,又与炎性对照组存在特异性,再提出与15种与肿瘤相关的炎性因子,在最大程度上排除了炎症因子对筛选肾母细胞瘤特异性蛋白质标记物的干扰,得到m/z峰位于8350Da和5363Da蛋白质标记物两个。3.3肾母细胞瘤血清非炎症性标记物的纯化及鉴定应用HPLC法分离纯化病例组血清样本中的m/z为6438Da的特异性标记物蛋白,同时将HPLC法得到的不同峰值的蛋白质及肽段分装并进行MALDI-TOF-MS检测,根据MALDI-TOF-MS蛋白质质谱图找出m/z为6438Da(SELDI-TOF-MS结果存在0.3%的差异)蛋白质或肽段样品。将检测出的m/z为6438Da的蛋白质或肽段样品分别酶解及通过2D-LC-LTQMS系统检测肽段。m/z为6438 Da的蛋白质或肽段其序列为:E.LK EFGNTLEDKA RELISRIKQS ELSAKMREWF SETFQKVKEK.G,通过将肽段导入SEQUEST检索程序并在Bioworks数据库检索,此肽段为载脂蛋白C-I(apolipoprotein C-I,APO C-I)的一个肽段。最后利用SEQUEST检索程序统计两种肽段在其鉴定的目标蛋白质中的覆盖率。3.4肾母细胞瘤瘤体组织非炎症性标记物的纯化及鉴定通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对目标蛋白进行分离纯化,根据Marker提供的参照标尺,确定胶体上目标条带(图3)。同时将目标蛋白质及肽段进行MALDI-TOF-MS检测,根据MALDI-TOF-MS蛋白质质谱图(图4)找出m/z为5363Da和8350Da(SELDI-TOF-MS结果存在0.3%的差异)蛋白质或肽段样品。根据Marker提供的参照标尺,在对应的分子量上,切除目标条带,酶解离心后,取上清液,利用MALDI-TOF/TOF平台对得到肽段混合物并进行检测。m/z为5363 Da的蛋白质或肽段其序列为:K.IQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLS DYNIQKESTLHLVLRLR.G。通过将肽段导入Mascot检索程序并在Swissprot数据库检索,此肽段为泛素(Ubiquitin,UBIQ)的一个肽段。m/z为8350 Da的蛋白质或肽段其序列为:K.DSPSVWAAVPGKTFVNITPAEVGVLVGKDRSSFYVN GLTLGGQKCSVIRDSLLQDGEFSMDLRTKSTGGAPTFNVTVK.T。通过将肽段导入Mascot检索程序并在Swissprot数据库检索,此肽段为前纤维蛋白-1(Profilin-1,PFN1)的一个肽段。3.5 ELISA验证肾母细胞瘤血清非炎症性蛋白标记物在血清中的表达我们使用ELISA对肿瘤组血清和正常组血清中的APO C-I蛋白质的表达进行检测。通过标准品的吸光值数据绘制出标准曲线,将待测样品的吸光值带入公式得到肿瘤组和正常组组织中的APO C-I蛋白质的浓度,结果表明APO C-I在肿瘤组中低表达,在正常组中高表达。3.6 RT-PCR验证肾母细胞瘤瘤体组织非炎症性蛋白标记物在组织中的基因表达为了验证MALDI-TOF-TOF鉴定的目标蛋白质就是Ubiquitin和Profilin-1,我们使用实时荧光定量PCR对Ubiquitin和Profilin-1基因进行检测,通过Real-time PCR分析表明,Ubiquitin基因在肿瘤组组织中低表达,在正常组组织中高表达;Profilin-1基因在肿瘤组组织中高表达,在正常组组织中低表达。3.7 ELISA验证肾母细胞瘤体组织非炎症性蛋白标记物在组织中的表达我们使用ELISA对肿瘤组和正常组组织中的Ubiquitin和Profilin-1蛋白质的表达进行检测。通过标准品的吸光值数据绘制出标准曲线,将待测样品的吸光值带入公式得到肿瘤组和正常组组织中的Ubiquitin和Profilin-1蛋白质的浓度,结果表明Ubiquitin在肿瘤组组织中低表达,在正常组组织中高表达;Profilin-1在肿瘤组组织中高表达,在正常组组织中低表达。4结论通过本研究证实了质荷比为6438Da的蛋白质或肽段为APO C-I,这种蛋白质的表达量在肾母细胞瘤患儿血清与正常组血清中均具有差异性,其结果与课题组前期的研究结果相契合;同时,本研究证实了质荷比5363Da和8350Da的蛋白质或肽段为泛素和前纤维蛋白-1,这两种蛋白质的表达量在肾母细胞瘤患儿瘤体组织与正常组组织中均具有差异性,也证实了肾母细胞瘤血清与组织中没有相同或相似的蛋白质标记物;并且在此次研究中最大程度的剔除了炎症因子对寻找肾母细胞瘤蛋白质标记物的干扰,使鉴定出的肾母细胞瘤蛋白质标记物的蛋白质更具有特异性。通过本课题的研究,不仅得到了特异性更强的肾母细胞瘤蛋白质标记物,更验证了通过新的实验思路和技术流程来鉴定肿瘤组织蛋白质标记物的可操作性,同时也为鉴定其他肿瘤的非炎症性蛋白质标记物提供了实验思路。