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调节性T细胞(Tregs)在免疫调节和维持外周免疫耐受方面起重要作用。由于从供者外周血采集分离到的Tregs的数量有限,新鲜分离的Tregs需要在体外进行扩增以获得临床应用所需的Tregs细胞数。已有文献报道人Tregs可以在体外有效扩增,但是扩增后的Tregs是否能够在体内有效抑制急性移植物抗宿主病(aGVHD)还不清楚。本文从脐带血中分离CD4+CD25+细胞以及从成人外周血中分离CD4+CD25+CD127-细胞进行体外扩增,比较扩增后Tregs的免疫抑制功能。脐带血和外周血Tregs通过两轮多克隆刺激或第一轮同种异基因抗原刺激加第二轮多克隆刺激进行体外扩增。两轮扩增结束后检测Tregs的表型、分泌的细胞因子以及抑制功能。采用C57BL/6小鼠骨髓和脾细胞移植经致死性照射的DBA/2小鼠建立aGVHD模型。Tregs治疗组用体外扩增的脐带血或外周血Tregs过继性输注治疗aGVHD模型小鼠。分析比较Tregs治疗组和对照组小鼠生存率、体重、GVHD症状评分、组织病理学标本、血清细胞因子、Th细胞亚群。脐带血和外周血Tregs多克隆扩增两轮后平均分别扩增1.5×103和1.8×103倍,而采用第一轮同种异基因抗原特异性扩增加第二轮多克隆扩增后的平均扩增倍数分别是5×102和4.7×102。扩增的Tregs高表达Foxp3、CD39、CTLA-4,低表达CD127、IL-2、IFN-Y,并且维持了免疫反应无能性。采用两轮多克隆扩增的脐带血Tregs不仅能够抑制广谱扩增的效应T细胞(Tresp)增殖,而且还能够抑制HLA抗原不相合的树突状细胞激活的效应T细胞增殖。当两轮多克隆扩增的脐带血或外周血Tregs输注aGVHD模型小鼠后,分别有87.5%和16.7%的小鼠存活期超过63天,而aGVHD模型小鼠在18天里全部死亡。第7天时扩增脐带血Tregs治疗组小鼠体内IFN-γ和TNF-a含量显著低于aGVHD模型小鼠。接着Tregs治疗组小鼠体内IFN-γ、TNF-α、IL17的含量迅速降低并维持在低水平,而TGF-β的含量持续上升。小鼠体内免疫细胞亚群的变化与小鼠体内血清细胞因子含量变化是同步的：Th1细胞百分比从第7天的30%下降到第14天的10%并维持在低水平；小鼠CD4+Foxp3+细胞(Tregs)比例持续上升而IL-17阳性细胞(Th17)则从高水平(约40%)降低到2%以下。在Tregs治疗组小鼠体内,脐带血Tregs表面的CD39分子能够抑制小鼠T细胞的扩增,而分泌的TGF-β则诱导Treg/Th17平衡向Tregs方向偏移。采用两轮多克隆扩增的脐带血Tregs比外周血Tregs具有更强的免疫抑制功能,能够通过表达CD39分子和分泌TGF-β减轻小鼠同种异基因骨髓移植aGVHD症状,表明脐带血Tregs具有临床应用治疗aGVHD的潜力。本文建立的从脐带血和外周血扩增Tregs的方法能够在体外获得大量的满足临床治疗需求的多克隆或同种异基因抗原特异性的调节性T细胞。