第一章自发性高血压大鼠主动脉中profilin-1蛋白表达研究背景原发性高血压(essential hypertension, EH)是多种心、脑血管疾病的重要病因及危险因素。血管重构是引起高血压血管疾病和循环功能紊乱的病理基础,逆转高血压重构,对高血压的防治有着重要意义。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的增殖、凋亡和重塑参与了血管重构过程。肌动蛋白的聚合-解聚的动态平衡在血管重构、血管平滑肌细胞增殖、迁移以及血管阻力调节中起着极为重要的作用。Profilin通过影响肌动蛋白的聚合-解聚的动态变化,参与调控细胞的增殖、迁移、分化、粘附、血管形成、收缩力及信号转导。Profilin-1通过促进肌动蛋白聚合及其细胞骨架动力学的改变,加速血管炎症的形成,加重血管增殖、重塑,导致血管壁结构易受到改变,包括血管壁增厚、横截面积增加以及腔直径减少,最终促使血管阻力增加,引起血压升高。研究显示,糖尿病患者和糖尿病大鼠主动脉内皮细胞中profilin-1表达均显著增加,对大鼠内皮细胞过表达profilin-1可引起内皮功能失调,动脉粥样硬化大鼠主动脉和人冠状动脉平滑肌细胞中profilin-1水平明显增加,冠心病患者的动脉硬化斑块中profilin-1表达也显著升高,并且,profilin-1增加的水平与人类动脉硬化程度显著相关。基于profilin对血管重构、细胞增殖等的调控效应,本实验以自发性高血压大鼠(SHR)为研究对象,检测大鼠主动脉profilin-1 mRNA和蛋白表达,观察白发性高血压大鼠主动脉profilin-1的表达。方法动物实验：雄性SHR24只,雄性Wistar京都大鼠(WKY)8只。将SHR随机分为3组：(1)SHR组(n=8)；(2)氯沙坦低剂量组(L-Losartan组)(n=8),给予氯沙坦(15 mg/kg/d)灌胃,每天一次,连续给药4周；(3)氯沙坦高剂量组(H-Losartan组)(n=8),给予氯沙坦(30 mg/kg/d)灌胃,每天一次,连续给药8周。WKY组及SHR组均同时给予等体积生理盐水灌胃处理,每天一次,连续8周。治疗前后,分别测定大鼠收缩压。取大鼠全血,分离血浆检测非对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine, ADMA)水平；分离大鼠胸主动脉,分为三段：上段采用Real-time PCR法检测profilin-1 mRNA水平；中段及肠系膜三级动脉进行苏木精-伊红(HE)染色,检测大鼠胸主动脉及肠系膜动脉管壁内中膜厚度(nedia thickness, MT)、管腔内径(lumen diameter, LD)、计算中膜厚度与内径比值(MT/LD),并采用免疫组织化学法检测profilin-1蛋白表达；下段采用western blot法检测profilin-1蛋白表达。结果实验前三组SHR之间血压无明显差异,均明显高于WKY组。实验后L-Losartan和H-Losartan组SBP均低于SHR组,且高于WKY组。实验后H-Losartan组血压明显低于L-Losartan组。SHR组血浆ADMA水平明显高于WKY组,实验后L-Losartan和H-Losartan组血浆ADMA水平均低于SHR组。HE染色表明SHR组主动脉及肠系膜动脉MT、MT/LD均明显高于WKY组,SHR组肠系膜动脉LD明显低于WKY大鼠,这种作用可被氯沙坦所逆转。SHR组主动脉profilin-1 mRNA及蛋白表达均明显高于WKY组,氯沙坦可抑制SHR大鼠主动脉profilin-1的表达。结论Profilin-1可能参与自发性高血压大鼠的血管重构,氯沙坦可降低SHR大鼠主动脉profilin-1的表达。第二章Profilin-1在非对称二甲基精氨酸诱导的血管平滑肌细胞增殖中的作用研究背景一氧化氮(nitric oxide, NO)是内皮细胞衍生的重要活性介质和维持正常血管结构及功能的主要成分之一,NO在抑制VSMCs增殖、抑制血小板聚集和白细胞的黏附、介导炎症和免疫反应、参与神经信号传递、减少氧自由基形成等方面发挥重要的生理作用。NO主要是在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)的作用下,由L-精氨酸脱氨基作用产生。非对称二甲基精氨酸(ADMA)为精氨酸类似物,是巨噬细胞和血管内皮细胞NOS的内源性竞争性抑制剂,ADMA由蛋白精氨酸甲基转移酶催化而生成,经DDAH水解为L-胍氨酸和二甲胺。ADMA通过竞争性与NOS结合,导致由精氨酸产生的NO减少,引起血管内皮舒张功能障碍,削弱NO对VSMCs增殖的抑制作用,加剧血管重构。本实验通过构建靶向profilin基因的RNA干扰(RNAi)载体,探讨了profilin-1对ADMA诱导的大鼠平滑肌细胞(rat aortic smooth muscle cells, RASMCs)增殖的影响。方法实验分为外源性给予不同浓度ADMA(1μM,3μM, 10μM,30μM),于不同时间点(6h,12 h,18 h,24 h)作用于RASMCs,应用噻唑蓝(MTT)比色法检测ADMA对RASMCs增殖的作用；用流式细胞仪检测ADMA对RASMCs周期的影响；用western blot法检测ADMA对RASCMs profilin-1蛋白表达的影响。以终浓度为1μM和10μM的氯沙坦分别与终浓度为30μM的ADMA诱导的RASMCs孵育24h,用MTT比色法检测氯沙坦对ADMA诱导的RASMCs增殖的影响；用流式细胞仪检测氯沙坦对ADMA诱导的RASMCs周期的影响；用western blot法检测氯沙坦对ADMA诱导的RASMCs profilin-1表达的影响。构建及提取profilin-1 shRNA重组质粒,建立稳定RASMCs细胞株,采用G418浓度梯度试验筛选阳性克隆细胞,利用脂质体转染RASMCs。用MTT比色法检测profilin-1 shRNA对RASMCs增殖的作用；用流式细胞仪检测profilin-1 shRNA对RASMCs周期的影响；用western blot法检测干扰48h后profilin-1蛋白的抑制率；用RT-PCR法检测profilin-1 mRNA的变化；用western blot法检测profilin-1蛋白表达。结果ADMA呈浓度和时间依赖性促进RASMCs增殖,且以30μM ADMA作用24h时效果最明显。ADMA可呈浓度及时间依赖性上调RASCMs profilin-1蛋白的表达。氯沙坦能抑制ADMA诱导的平滑肌细胞增殖效应,并降低profilin-1 mRNA和profilin-1蛋白的表达。成功构建了profilin-1 shRNA重组质粒,与空白对照组相比,profilin-1 shRNA重组质粒转染组profilin-1 mRNA和profilin-1蛋白表达明显减少,细胞增殖活性显著降低。结论ADMA可诱导血管平滑肌细胞增殖,上调profilin-1的表达,这一作用可被氯沙坦所抑制。Profilin-1 shRNA重组载体能有效抑制profilin-1在RASMCs内的表达和ADMA诱导的RASMCs的增殖。第三章JAK2/STAT3信号通路对非对称二甲基精氨酸诱导的血管平滑肌细胞profilin-1表达的影响研究背景血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)是构成血管壁中层组织结构及维持血管张力的主要细胞成分,平滑肌细胞的收缩、舒张、增殖、迁移、纤维化是多种心血管病的细胞病理学基础,VSMCs的异常增殖是高血压血管重构以及血管增殖性疾病的发生发展的主要病理基础。JAK2/STAT3信号转导通路与细胞增殖密切相关,是VSMCs胞内信号转导的重要通路,其对细胞的生理和病理反应发挥着重要调控作用。JAK2/STAT3信号途径被多种炎症因子(IL-2.IL-4.IL-6等)、生长因子(EGF、PDGF、CSF等)和环境应激反应等激活,促使带有酪氨酸的蛋白发生磷酸化,产生激酶活化的级联反应,将活化的信号传导给其他分子如STAT,引起细胞应激、生长、增殖、分化、凋亡等,从而介导细胞免疫功能调节、造血细胞生成、肿瘤发生、炎症及神经和胚胎发育等,发挥着特异又多效性的生物学功能。Profilin-1可通过促进VSMCs细胞外信号调节激酶1/2(extracellular regulated kinase, ERK1/2)、Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase, JNK)以及p38-MAPK的磷酸化水平及JAK2/STAT3信号通路,促进肌动蛋白聚合及细胞骨架动力学的改变,诱发血管炎症的形成,加重血管增殖、重塑,促使血压升高。本实验初步探讨了JAK2激酶抑制剂AG490和STAT3抑制剂雷帕霉素(rapamycin, RPM)对ADMA诱导的RASMCs profilin-1蛋白表达的影响及可能机制。方法分别以JAK2激酶抑制剂AG 490(终浓度为5×10-5M)和STAT3抑制剂RPM(终浓度为10-8M)及二者联合作用于RASMCs,然后以终浓度为30μM的ADMA溶液处理RASMCs 24 h。应用MTT法检测细胞增殖状态；流式细胞仪检测AG490, RPM对细胞周期的影响；western blot法检测RASMCs中profilin-1蛋白表达。结果预先给予AG490和RPM处理RASMCs 1 h后,pofilin-1 mRNA和profilin-1蛋白表达均明显下降,同时细胞蛋白含量显著减少,细胞吸光度值明显降低。单独给予AG490和RPM,对profilin-1 mRNA和profilin-1蛋白表达无影响。结论JAK2激酶抑制剂AG490和STAT3抑制剂RPM可能通过阻断JAK2/STAT3信号通路的活化抑制ADMA诱导的RASMCs增殖,这一作用可能是通过抑制profilin-1的表达所实现。