研究目的:尽管全肿瘤细胞裂解物已经被作为肿瘤抗原的来源用于癌症疫苗的研发,但是目前基于肿瘤细胞裂解物制备树突状细胞疫苗的抗肿瘤免疫治疗的临床试验结果不容乐观。肿瘤细胞裂解物作为肿瘤抗原制备肿瘤免疫治疗疫苗的疗效尚有较大的改进空间。因此,通过这种方式制备的肿瘤疫苗诱导的抗肿瘤免疫反应的新技术和方法有待进一步增强。为了改善基于肿瘤细胞裂解物疫苗的治疗效果,生物材料在提高抗原递送和提呈等方面具有很重要的作用。本研究构建了一种以壳聚糖纳米粒为基础,具有甘露糖受体靶向的新型还原响应多糖纳米载体,通过静电吸附作用实现与肿瘤细胞裂解物结合形成纳米粒疫苗,能够有效提呈肿瘤抗原和活化T细胞,并通过引入靶向树突状细胞(Dendritic cells,DCs)的官能基团和佐剂增强肿瘤抗原的免疫原性以及机体对疫苗的免疫应答效果。方法:首先将壳聚糖与肿瘤细胞裂解物通过静电吸附方式结合,同时合成甘露糖修饰的海藻酸钠(Man-ALG),通过静电吸附方式与壳聚糖负载的肿瘤细胞裂解物结合形成纳米粒疫苗制备甘露糖修饰的壳聚糖负载肿瘤细胞裂解物纳米粒(Man-CTS-TCLNPs)。通过核磁共振氢谱(1H-NMR)和红外光谱(IR)来表征化学结构,透射电镜(TEM)确定结构;利用BCA法测定在不同的pH值下Man-CTS-TCLNPs中蛋白的释放情况;CCK-8法以及LDH法评价纳米粒对骨髓来源的树突状细胞(BMDC)的毒性;通过激光共聚焦以及流式细胞仪检测BMDC对Man-CTS-TCL NPs的摄取并进行定性和定量分析;体内外评价Man-CTS-TCL NPs对骨髓来源的树突状细胞促成熟能力,流式细胞仪检测与BMDC成熟相关的表面标志的表达情况,ELISA法检测炎症相关细胞因子的分泌情况;利用小动物活体成像系统考察皮下注射Man-CTS-TCL NPs后其在体内的分布情况以及向回流淋巴结的迁移能力;通过三种不同的动物模型(预防性模型、治疗性模型以及肺转移模型)来研究这种新型的纳米粒疫苗的抗肿瘤效应,并探讨其作用机制。结果:我们成功地制备了 Man-CTS-TCLNPs纳米疫苗,并通过1H-NMR和IR确定了其结构。TEM结果显示Man-CTS-TCLNPs具有特征性的球型结构,在pH为5.0时能够更持久的释放抗原。壳聚糖负载肿瘤细胞裂解物纳米粒(CTS-TCLNPs)和Man-CTS-TCL NPs可以有效地被BMDC细胞摄取,毒性实验结果显示Man-CTS-TCL NPs具有良好的生物学相容性。Man-CTS-TCL NPs组的细胞摄取明显增加,体内更具有抗原提呈细胞靶向性,皮下注射后24 h主要分布在回流淋巴结。Man-CTS-TCL NPs可以增强树突状细胞表面标志CD80、CD86、CCR7、MHCI、MHCII以及CD40的表达,相应的细胞因子IFN-γ、IL-4等的表达也上调。预防性动物模型结果显示,免疫的纳米粒疫苗组小鼠能够延缓肿瘤的出现,具有较好的抑制肿瘤生长效果。治疗性动物模型结果显示,与其他组相比,Man-CTS-TCL NPs治疗组,肿瘤的体积以及重量明显的减小,具有统计学差异。荷瘤小鼠用纳米粒疫苗免疫后,具有增强的CTL反应,且小鼠体内的抗TCL特异性抗IgG抗体水平也显著提高,小鼠血清中IFN-γ的分泌明显增强。荷瘤鼠肺部转移模型结果显示,Man-CTS-TCL NPs通过尾静脉注射后,能够抑制黑色素瘤细胞向肺部的转移情况,这种效果可能是通过活化小鼠外周血中的细胞毒性T细胞发挥杀伤作用来完成的。结论:总之,我们成功的制备了壳聚糖纳米粒,构建了甘露糖修饰的壳聚糖纳米粒负载肿瘤细胞裂解物疫苗,这种疫苗具有较低的细胞毒性,更容易被抗原提呈细胞摄取,能够靶向到体内的抗原提呈细胞并可在回流淋巴结中聚集,体内外结果显示能够诱导未成熟DC细胞的成熟,促进细胞因子的释放,体内的预防性以及治疗性实验证明了此纳米粒疫苗具有良好的预防黑色素瘤形成以及抑制肿瘤生长和转移的效果。在肺转移模型中,能够抑制黑色素瘤细胞向肺部的转移情况。本课题成功的设计了新型的靶向树突状细胞的壳聚糖纳米粒疫苗,为探索基于纳米生物材料的抗肿瘤免疫疗法提供了一定的理论基础。