巨胚水稻糙米中含有丰富的g-氨基丁酸(GABA)、蛋白质、脂肪、氨基酸、维生素、矿物质等营养成分,因此巨胚稻米被认为是一种高营养的功能性稻米。巨胚水稻胚体积是普通胚水稻胚体积的2-3倍。本实验室前期以“超2-10”水稻成熟胚为外植体进行离体培养获得巨胚突变体“上师大5号”水稻,并对“上师大5号”和“超2-10”开花后6天、10天、14天的颖果进行全基因组表达谱芯片分析,发现有5个膨胀素基因(OsEXPA1,OsEXPA4,OsEXPA8,OsEXPB2,OsEXPB18)在种子胚发育关键时期显著上调。根据已有报道发现膨胀素基因可能是参与细胞壁膨胀过程的关键基因,由此本研究以巨胚水稻“上师大5号”和正常胚水稻“超2-10”为材料,选取表达水平在巨胚水稻“上师大5号”中显著提高的5个膨胀素基因为研究对象,研究膨胀素基因在巨胚水稻巨胚性状形成过程中的作用。本研究主要内容和结果如下:1.对这5个以及其他在水稻种子中表达的13个膨胀素基因进行染色体定位分析,结果显示这18个膨胀素基因分别分布在水稻不同的染色体上。2.利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对这5个膨胀素基因分别设计两个靶点构建了10个CRISPR-Cas9敲除载体,并利用根癌农杆菌介导法将每个载体同时侵染转化“上师大5号”和“超2-10”水稻,其中得到了不同数量的OsEXPA4,OsEXPA8,OsEXPB2基因敲除阳性植株,但经测序鉴定目的基因均未突变;经遗传转化得到3棵OsEXPB18纯合敲除突变植株以及2棵OsEXPA1杂合突变植株并对其进行转录水平分析,结果发现目的基因表达量与非转基因对照水稻“超2-10”相比均有极显著下调;根据生物信息学网站对目的基因编码蛋白序列和功能结构域预测分析,结果显示,突变体目的基因的碱基突变对其相应膨胀素蛋白的重要结构功能域均有不同程度的破坏;通过田间观察,发现OsEXPB18纯合敲除突变植株出现育性低的表型,通过花粉粒碘染活性检测,结果显示约42%-70%的OsEXPB18纯合敲除突变植株的花粉粒与对照相比出现了圆败的表型;对其种子进行观察统计后发现,它的结实率也比对照显著下降,并且整粒种子体积有变小的趋势。3.对已获得的OsEXPA4过表达转基因植株进行种植,转录水平分析发现,与非转基因对照水稻“超2-10”相比,OsEXPA4基因表达水平在OsEXPA4过表达植株中极显著上调;通过田间观察,我们发现OsEXPA4过表达植株呈现植株矮化和育性低的表型,通过对其与对照花粉粒进行碘染活性检测,结果显示OsEXPA4过表达植株的花粉粒与非转基因“超2-10”水稻相比,花粉粒总数减少了约56%,其中约78%出现染色较浅的败育花粉表型;通过种子观察分析,发现OsEXPA4过表达植株大部分不育,有且仅有一株目的基因表达量上调倍数最低的植株有种子,且结实率(5%)显著低于对照(90%),而与对照种子相比,它的整粒种子体积大小无明显变化,而胚体积有变小的趋势。本研究成功再次验证CRISPR-Cas9系统能有效的应用于水稻的基因编辑,对目的基因具有一定的敲除效率,且这一编辑系统能跟随水稻的遗传在子代中持续发挥编辑作用。根据本研究结果我们推测,膨胀素基因可能参与了调控水稻种子的体积、花粉的发育、结实等众多生理过程,且不同膨胀素基因可能有不同的调控作用。本研究为进一步深入开展膨胀素基因在调节水稻种子胚与胚乳比例的分子机理研究以及膨胀素基因对水稻花粉育性作用的研究都奠定了重要的基础。