单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,简称Lm）是一种能够在高盐（10%NaCl）、较宽的pH（4.5-9.0）和温度（0-45℃）等多种极端环境中生存的革兰氏阳性、食源性致病菌,食品在加工及运输过程中易受其污染,人类和动物等摄入污染的食品后将会感染李斯特菌病。在美国及欧洲等西方发达国家,Lm导致的临床发病率大约为十万分之二到八,死亡率为百分之二十到三十。Lm进入机体消化道后,需耐受胃肠道内复杂的生理生化环境,比如胃酸所导致的低pH环境、高渗透压和随胆汁进入肠道的胆盐等;然后突破机体的肠道屏障进入血液循环,进而定植于肺、肝脏、脾脏和脑等组织或器官。因此,能否在胃肠道的极端环境生存是其成功感染宿主的首要条件。研究发现,Lm对环境中胆盐的耐受能力以及致病性的高低与其体内众多双组分信号转导系统（Two-Component Signal Transduction System,TCS）的作用息息相关。本研究以临床分离Lm菌株10403S为研究对象,在构建10403SyycH基因缺失株和回复株的基础上,探究了双组分系统中组氨酸激酶编码基因yycH增强Lm胆盐耐受和毒力的分子机制。首先对其在Lm生长繁殖、形态结构和环境胁迫等方面所发挥的功能进行了研究;然后以巨噬细胞RAW 264.7、宫颈癌细胞Hela为体外感染模型、C57BL/6小鼠为体内感染模型,研究了yycH在Lm感染和定植中发挥的功能。本研究有助于揭示yycH在Lm抗胁迫与致病中发挥的重要作用与分子机制,为李斯特菌病的预防和控制奠定理论基础。1.单核细胞增生李斯特菌yycH突变株的构建将10403基因组与P2CS数据库比对、识别,结果显示其中含有13对双组分系统和5个孤独的TCS功能组分;利用TMHMM、SWISS、Smart和String等生物信息学软件对yycH进行结构和功能预测,结果表明yycH编码长度为440个氨基酸的跨膜蛋白YycH,其三维结构与枯草芽孢杆菌的YycH相似。蛋白互作预测结果显示,yycH可能与转录调控因子YycI、细胞分裂必须蛋白FtsL、染色体复制起始蛋白DnaB和DNA结合转录调节蛋白OmpR等存在互作关系。以Lm 10403S的基因组DNA作为模板,对yycH基因进行扩增。将yycH基因与原核表达载体pGEX-6p-1连接,转化至大肠杆菌感受态细胞DH5a中,将测序正确的重组质粒（pGEX-6p-1）-yycH转化至终宿主菌BL21中,获得重组菌株BL21-（pGEX-6p-1）-yycH。通过IPTG诱导重组菌株高效表达YycH,最终获得大小为76 KDa的可溶性GST-YycH重组蛋白。为了构建yycH缺失株和回复株,从Lm 10403S基因组中扩增上、下游同源片段并与开环的pAULA质粒连接,将重组质粒电转化至Lm感受态细胞,利用同源重组技术,成功构建yycH缺失株10403SΔyycH和回复株10403SΔyycH::yycH。对突变株的生长曲线和耐药性进行测定,结果表明yycH不影响细胞壁结构,但与细菌进入对数期和稳定期的生长密切相关。2.单核细胞增生李斯特菌yycH突变株的生物学特性研究为了揭示yycH在抗胁迫与致病中发挥的功能,本研究对Lm进行了一系列生物学特性的研究。10403SΔyycH在胆盐培养基中呈“长丝状”生长,且生长速率显著降低,提示yycH在Lm分裂繁殖中发挥重要作用。在42℃培养条件下,BHI培养基和胆盐培养基中的10403SΔyycH生物被膜形成量显著降低,提示yycH在细菌抗胁迫方面发挥一定功能。另外,yycH有助于提高Lm在胆盐胁迫中对呋喃妥因的耐药性。qRT-PCR结果表明yycH基因的缺失导致Lm毒力基因（inlA、ami、iap、prfA和murA）、胆盐耐受基因（bsh、brtA和prfA）及其下游反应调节蛋白编码基因yycI的相对表达量显著下降,提示yycH与yycI存在互作关系,能正向调控Lm抗胆盐胁迫和毒力基因的表达。以Hela和RAW 264.7细胞系作为体外感染模型测定Lm的感染能力,结果显示,10403SΔyycH对Hela和RAW 264.7细胞的粘附、侵袭能力均显著低于野生株和回复株。以C57BL/6小鼠作为体内感染模型测定Lm的毒力,结果显示缺失株在回肠、结肠和盲肠中的定植能力均显著低于野生株和回复株,表明yycH有助于提高Lm的感染能力,在肠道定植中发挥重要作用。3.yycH响应胆盐胁迫的分子机制双组分系统通过感应环境变化或接受信号刺激调节菌体代谢,使细菌在胁迫环境中作出适应性应答。为了深入研究yycH在响应胆盐胁迫及调控毒力的分子机制,本研究对胆盐培养基中培养的Lm和感染10403S、10403SΔyycH的小鼠胆囊进行RNA-seq分析。从含有0.2%胆盐的BHI培养基中收集Lm进行RNA-seq测序,以p-value＜0.05且|log2FoldChange|＞1作为判断标准,对测序数据进行差异基因的筛选。随机选择10个差异基因进行qRT-PCR检测,结果与RNA-seq趋势一致,表明测序结果具备可靠性。结果显示,在胆盐胁迫条件下,差异基因的总数量为434个,包含208个在缺失株中显著上调和226个显著下调的基因。其中,与LPXTG细胞壁锚定相关的lmo2714、与生物被膜形成相关的trpE、与磷壁酸合成相关的dltA、dltB、dltC等基因在10403SΔyycH中显著下调;DNA结合转录激活因子pyrR、与细胞形态决定相关的mreBH、与细胞分裂相关的ftsE、ftsX等基因在10403SΔyycH中显著上调。此外,胆盐水解酶编码基因bsh和毒力基因hly在10403SΔyycH中下调表达。上述结果表明,当环境中存在胆盐时,yycH通过调节ftsE、ftsX、mreBH的表达量维持Lm正常的生长、分裂和繁殖;调节毒力基因hly等的表达增强Lm的感染能力;调节trpE和bsh的表达量提高Lm的生物被膜形成能力和对进入菌体内的胆盐的水解能力,进而促进Lm在胆盐胁迫环境中的适应性生存。综上所述,yycH有利于维持Lm在胆盐胁迫环境中的细胞稳态和分裂状态、增强细菌的胆盐耐受能力,提高Lm在胆盐胁迫中对呋喃妥因的耐药性;此外,yycH有利于维持Lm的生长繁殖和生物被膜形成能力,增强Lm对宿主细胞的感染能力,促进Lm在小鼠肠道中的定植。本研究初步揭示了yycH增强Lm胆盐耐受的分子机制,在胆盐胁迫下,yycH通过调控细菌生长繁殖、生物被膜形成及毒力,对Lm在宿主胃肠道和胆囊环境的适应性生存中发挥重要作用,有望成为新的药物靶标,对李斯特菌病的防治具有重要的临床意义。