【摘 要】
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目的:探讨miR-210-3p在侵袭性无功能垂体腺瘤与非侵袭性垂体腺瘤中的表达差异,以及miR-210-3p对MMQ和GH3垂体瘤细胞的增殖和迁移的影响,并预测miR-210-3p的靶基因,并为之进行验证,为侵袭性无功能垂体腺瘤的超前诊断和相关治疗提供新的思路和新的靶点。方法:1.使用Real-time PCR的方法来检测临床收集的20例侵袭性无功能垂体腺瘤（Nonfunctional pitui
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目的:探讨miR-210-3p在侵袭性无功能垂体腺瘤与非侵袭性垂体腺瘤中的表达差异,以及miR-210-3p对MMQ和GH3垂体瘤细胞的增殖和迁移的影响,并预测miR-210-3p的靶基因,并为之进行验证,为侵袭性无功能垂体腺瘤的超前诊断和相关治疗提供新的思路和新的靶点。方法:1.使用Real-time PCR的方法来检测临床收集的20例侵袭性无功能垂体腺瘤（Nonfunctional pituitary adenoma,NFPA）和20例非侵袭性NFPA的肿瘤组织中miR-210-3p的表达水平,验证二者之间的miR-210-3p的表达差异。2.将培养好的大鼠垂体瘤MMQ与GH3细胞株分为低表达miR-210-3p组和无义序列阴性对照载体（Negative control,NC）组,分别转染miR-210-3p inhibitor和miR-210-3p NC,使用荧光定量PCR技术检测实验组与对照组的miR-210-3p的表达情况。3.转染后第一、二、三个24h行CCK-8法检测增殖能力。4.Transwell技术检测低表达miR-210-3p与对照组MMQ与GH3垂体瘤细胞（因MMQ与GH3细胞未非贴壁细胞,因此采用流式细胞术进行细胞计数）的迁移能力。5.使用Target Scan 7.2预测miR-210-3p的下游靶基因为FGFRL-1。6.用双荧光素酶报告实验验证miR-210-3p的靶基因。7.应用Western-blotting技术分别检测低表达miR-210-3p组和阴性对照组垂体瘤细胞中FGFRL-1的蛋白表达。结果:1.非侵袭性NFPA组织中miR-210-3p表达较侵袭性NFPA组织明显降低（P<0.05）。2.在垂体瘤细胞MMQ和GH3细胞系中,我们构建了miR-210-3p的干扰载体（Inhibitor）和无义序列阴性对照载体（NC）,进行转染,结果表明,在MMQ细胞系中,与MMQ-NC组相比,MMQ-Inh组中miR-210-3p的表达明显降低（P<0.01）;在GH3细胞系中,与GH3-NC组相比,GH3-Inh组中miR-210-3p的表达也降低（P<0.05）,表明转染成功。3.CCK-8结果提示转染低表达miR-210-3p病毒后MMQ与GH3垂体瘤细胞株的细胞增殖能力较阴性对照组降低（P<0.05）。4.Transwell结果提示低表达miR-210-3p组MMQ与GH3垂体瘤细胞系与阴性对照组相比,细胞数目明显减少,细胞迁移能力下降（P<0.05）。5.Targetscan生物信息学在线预测软件预测结果显示,miR-210-3p通过直接绑定在FGFRL-1的3’-UTR继而发挥靶向作用。6.双荧光素酶报告实验结果显示,在FGFRL-1 m RNA 3’UTR载体和miR-210-3p mimic共转染后,垂体瘤细胞中荧光素酶的活性显著降低（P<0.01）,提示FGFRL-1为miR-210-3p的直接靶点。7.Western blotting结果显示,MMQ和GH3细胞中,FGFRL-1蛋白的表达水平较低,而在低表达miR-210-3p后,MMQ和GH3细胞中FGFRL-1蛋白的表达显著增加（P<0.0001,P<0.01）。结论:1.miR-210-3p在侵袭性无功能垂体腺瘤新鲜肿瘤组织中的表达高于非侵袭性无功能垂体腺瘤。2.miR-210-3p可以促进MMQ、GH3垂体瘤细胞的增殖与迁移,这个结果给与了我们进一步研究侵袭性NFPA的分子机制的思路,有望通过miR-210-3p的分子途径,进行侵袭性NFPA的诊疗。3.通过软件预测以及实验验证,我们得到了miR-210-3p的靶基因为FGFRL-1,低表达miR-210-3p的MMQ、GH3垂体瘤细胞中FGFRL-1蛋白表达增加,FGFRL-1的主要功能是抑制肿瘤细胞的增殖,为我们进一步的研究提供了相关思路与线索。
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