帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是一种严重危害人类健康的中枢神经系统慢性退行性疾病。其根本病理变化为患者中脑黑质致密部（substantia nigra compacta,SNc）多巴胺（dopamine, DA）能神经细胞的进行性变性死亡。胶质细胞系源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF）可以促进DA能神经的存活，有可能从根本上解决PD病程中DA能神经细胞变性死亡的问题。深入探讨GDNF的保护机制对于PD的防治具有重要意义。2003年Paratcha等提出神经型细胞粘附分子（neural cell adhesion molecule, NCAM）可以作为GDNF家族的一种信号转导受体。但是NCAM是否介导了GDNF对DA能神经细胞的保护作用并不清楚。为了阐明NCAM在GDNF保护DA能神经细胞中的可能作用及其机制，本研究进行了下列三个部分的工作。一、建立6-OHDA损伤的DA能神经细胞模型用全反式维甲酸（all trans-retinoic acid，ATRA)和脑源性神经营养因子（BrainDerived Neurotrophic Factor，BDNF）序贯分化SH-SY5Y细胞，使其分化成为DA能神经细胞表型。然后用6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）损伤分化后的SH-SY5Y细胞建立体外培养的DA能神经细胞损伤模型。在本部分实验中：1.未分化的SH-SY5Y细胞存在不长于胞体的短突起。经RA/BDNF序贯分化后突起延伸，交织成网状，细胞形态呈现神经细胞表型。2.在未分化的SH-SY5Y细胞中，仅有少量的神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)和酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase，TH）表达，RA/BDNF序贯分化使SH-SY5Y细胞中NSE和TH的表达量明显增加，说明SH-SY5Y细胞分化成为多巴胺能神经细胞表型。3.6-OHDA对诱导分化的SH-SY5Y细胞的损伤作用呈浓度依赖性。其中40μM的6-OHDA作用24小时后细胞活性降到50%左右，因此选择40μM的6-OHDA作为后续实验的处理浓度。4.40μM的6-OHDA作用4小时，检测到Cleaved caspase-3少量表达，6-OHDA作用6小时，8小时，10小时，Cleaved caspase-3表达量逐渐增加。6-OHDA作用10小时Cleaved caspase-3的表达量最多。因此在后继实验中，选择6-OHDA作用10小时的这个时间点进行凋亡检测。以上结果表明：经ATRA和BDNF序贯分化后，SH-SY5Y细胞分化成为DA能神经细胞表型。6-OHDA能够损伤分化后的SH-SY5Y细胞，使细胞活性降低，同时诱导细胞凋亡，使Cleaved caspase-3的表达增加。二、 NCAM介导了GDNF对6-OHDA损伤的DA能神经细胞的保护作用近年来发现神经型细胞粘附分子（neural cell adhesion molecule, NCAM）可以作为GDNF家族的一个信号转导受体。NCAM可以介导GDNF促细胞增殖、分化、迁移和突起生长等作用。但是NCAM是否介导了GDNF对神经毒素诱导凋亡的DA能神经细胞的保护作用并不清楚。为了探讨此问题，构建NCAM基因shRNA慢病毒载体和NCAM过表达慢病毒载体，干扰NCAM表达或促进NCAM过表达；运用CCK-8检测细胞活性；流式细胞仪检测细胞凋亡；Westernblot检测Cleaved caspase-3表达。观察NCAM是否介导了GDNF对6-OHDA损伤的SH-SY5Y细胞的保护作用。在本部分实验中：1.免疫印迹检测结果显示，在分化的SH-SY5Y细胞中主要表达NCAM-140，NCAM-180和NCAM-120的表达量很少。2.成功构建和制备靶向沉默NCAM基因的shRNA(short hairpin RNA, shRNA)慢病毒载体和NCAM基因过表达慢病毒载体。且Real-time PCR和Western blot检测结果表明NCAM-shRNA3慢病毒载体和NCAM过表达慢病毒载体能够在mRNA和蛋白水平分别抑制或促进NCAM mRNA及NCAM蛋白的表达，能为后续实验提供基本的实验工具。3. GDNF能以剂量依赖性的方式保护6-OHDA损伤的已分化的SH-SY5Y细胞。当GDNF浓度增加至50，100，200ng/ml时，细胞活性分别恢复到正常对照组细胞的75.48±4.2%，78.98±4.47%，80.37±4.49%，从经济而有效的角度考虑，在后继的实验中我们选择50ng/ml的GDNF处理浓度。4. NCAM过表达或者shRNA抑制NCAM表达影响GDNF的保护作用4.140μM的6-OHDA作用24小时后，细胞活性降低到45.77±3.87%。GDNF处理后可以显著增加细胞活性至70.34±3.69%，与6-OHDA组相比差异有统计学意义（P<0.05），说明GDNF可以保护6-OHDA诱导的细胞损伤。NCAM+6-OHDA+GDNF组细胞活性升至87.45±4.77%，与6-OHDA+GDNF组相比，差异有统计学意义（P<0.05），说明NCAM过表达加强了GDNF对6-OHDA诱导的细胞损伤的保护作用。shRNA+6-OHDA+GDNF组细胞的活性为58.95±2.91%，与6-OHDA+GDNF组相比，细胞活性增加，差异显著（P<0.05）；与6-OHDA组细胞相比，细胞活性降低，差异有统计学意义（P<0.05），说明NCAM表达量减少后部分抑制了GDNF对6-OHDA诱导的细胞损伤的保护作用。4.2细胞未受损伤状态下，检测到的细胞凋亡率低，为0.34±0.02%。40μM的6-OHDA作用10小时后，细胞凋亡率升至30.67±1.96%。GDNF处理后可以显著降低细胞凋亡率，至17.48±1.98%，与6-OHDA组相比差异有统计学意义（P<0.05），说明GDNF可以抑制6-OHDA诱导的细胞凋亡，具有保护作用。NCAM+6-OHDA+GDNF组细胞凋亡率降至12.67±0.99%，与6-OHDA+GDNF组相比，差异有统计学意义（P<0.05），说明NCAM过表达促进了GDNF对6-OHDA诱导的细胞损伤的保护作用。shRNA+6-OHDA+GDNF组细胞凋亡率为22.98±1.28%，与6-OHDA+GDNF组相比，细胞凋亡率升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与6-OHDA组细胞相比，细胞凋亡率降低，差异有统计学意义（P<0.05），说明NCAM表达量减少后部分抑制了GDNF对6-OHDA诱导的细胞凋亡的保护作用。4.3细胞未受损伤状态下，检测不到Cleaved caspase-3的表达。40μM的6-OHDA作用10小时后，Cleaved caspase-3表达量增加（0.88±0.06）。GDNF处理后可以显著降低Cleaved caspase-3的表达量(0.49±0.05)，与6-OHDA组相比差异有统计学意义（P<0.05），说明GDNF可以降低6-OHDA诱导的Cleaved caspase-3的表达，具有保护作用。NCAM+6-OHDA+GDNF组Cleaved caspase-3的表达量为0.31±0.04，与6-OHDA+GDNF组相比，Cleaved caspase-3表达量减少，差异有统计学意义（P<0.05），说明NCAM过表达促进了GDNF对6-OHDA诱导的细胞损伤的保护作用。shRNA+6-OHDA+GDNF组Cleaved caspase-3的表达量为0.42±0.03，与6-OHDA+GDNF组相比，Cleaved caspase-3的表达量升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与6-OHDA组细胞相比，Cleaved caspase-3的表达量减少，差异有统计学意义（P<0.05），说明抑制NCAM表达后部分抑制了GDNF对6-OHDA诱导的细胞凋亡的保护作用。以上结果表明：GDNF可以提高6-OHDA损伤细胞的活性，降低细胞凋亡率和Cleaved caspase-3的表达，对6-OHDA引起的细胞损伤具有保护作用。NCAM的过表达可以促进GDNF的保护作用，细胞活性进一步升高，细胞凋亡率和Cleaved caspase-3的表达进一步减少。而降低NCAM表达量后可以使细胞活性降低，细胞凋亡和Cleaved caspase-3的表达量增加，部分地抑制了GDNF的保护作用。三、脂筏在NCAM介导GDNF保护DA能神经细胞中的作用脂筏（lipid rafts）是细胞膜上富含胆固醇、鞘磷脂的高度动态的微结构域。在NCAM信号转导中具有重要调控作用。脂筏是否参与了NCAM介导的GDNF对DA能神经细胞的保护过程并不清楚。用非离子型去垢剂TritonX-100和碘克沙醇密度梯度离心这两种方法分离脂筏，观察GDNF对NCAM在脂筏内外分布的影响。用2-BP抑制NCAM榈酰化，取消NCAM向脂筏转位，观察脂筏在NCAM介导GDNF保护DA能神经细胞中的作用。在本部分实验中：1. GDNF诱导NCAM向脂筏转位非离子型去垢剂TritonX-100分离脂筏，发现在没有GDNF作用时，脂筏上就存在一定量的NCAM，占到NCAM总量的11.08±0.69%，GDNF作用后，NCAM向脂筏转位增加。GDNF作用15min时，脂筏上NCAM的含量最多。利用OptiPrep密度梯度离心法分离脂筏，发现没有GDNF作用时，NCAM在脂筏上的含量为9.05±0.89%。GDNF作用15min后，NCAM在脂筏上的含量显著增加为30.47±2.98%，差异与0min组相比有统计学意义（P<0.05）。这与非离子型去垢剂的方法分离脂筏得到的实验结果相一致。2.蛋白质酰基转移酶抑制剂2-溴代棕榈酸(2-bromopalmitate，2-BP)抑制GDNF诱导的NCAM向脂筏转位20μM的2-BP预处理15分钟可以显著降低脂筏微区中NCAM的含量（17.25±1.02%），与GDNF处理组（37.56±2.97%）相比较差异有统计学意义。3.2-BP预处理抑制NCAM介导的GDNF的保护作用3.12-BP+6-OHDA+GDNF组的细胞活性降低至60.3±4.36%，与6-OHDA+GDNF组相比，细胞活性降低，差异有统计学意义（P<0.05）；2BP+6-OHDA+GDNF组的细胞活性高于6-OHDA组的细胞活性（P<0.05）。提示2-BP通过抑制NCAM向脂筏转位，部分抑制了GDNF对6-OHDA损伤的神经细胞的保护作用。NCAM+2BP+6-OHDA+GDNF组细胞活性为61.59±3.91%，与NCAM+6-OHDA+GDNF组相比，细胞活性降低，差异有统计学意义（P<0.05）；NCAM+2BP+6-OHDA+GDNF组与shRNA+6-OHDA+GDNF组相比，细胞活性高，但是两组之间的差异没有统计学意义（P>0.05）。3.22-BP+6-OHDA+GDNF组细胞凋亡率为22.83±1.09%，与6-OHDA+GDNF组相比，细胞凋亡率增加，差异有统计学意义（P<0.05）；与6-OHDA组相比，2-BP+6-OHDA+GDNF组的细胞凋亡率仍然低于6-OHDA组的细胞凋亡率（P<0.05）。提示2-BP通过抑制NCAM向脂筏转位，部分抑制了GDNF对6-OHDA损伤的神经细胞的保护作用。NCAM+2BP+6-OHDA+GDNF组细胞凋亡率为21.69±1.39%，与NCAM+6-OHDA+GDNF组相比，细胞凋亡率增加，差异有统计学意义（P<0.05）；NCAM+2BP+6-OHDA+GDNF组与shRNA+6-OHDA+GDNF组相比，两组之间细胞凋亡率没有显著差异（P>0.05）。3.32-BP+6-OHDA+GDNF组Cleaved caspase-3相对表达量为0.79±0.05，与6-OHDA+GDNF组相比， Cleaved caspase-3表达量增加，差异有统计学意义（P<0.05）；与6-OHDA组相比，2-BP+6-OHDA+GDNF组的Cleaved caspase-3表达量仍然低于6-OHDA组Cleaved caspase-3表达量（P<0.05）。提示2-BP通过抑制NCAM向脂筏转位，部分抑制了GDNF对6-OHDA损伤的神经细胞的保护作用。NCAM+2BP+6-OHDA+GDNF组Cleaved caspase-3相对表达量为0.77±0.06，与NCAM+6-OHDA+GDNF组相比，Cleaved caspase-3表达量增加，差异有统计学意义（P<0.05）；NCAM+2BP+6-OHDA+GDNF组与shRNA+6-OHDA+GDNF组相比，两组之间Cleaved caspase-3表达量没有显著差异（P>0.05）。以上结果表明：在没有GDNF作用时，脂筏上就存在一定量的NCAM， GDNF作用后NCAM向脂筏转位增加。2-BP抑制NCAM棕榈酰化能够抑制GDNF诱导的NCAM向脂筏的转位。并且抑制了GDNF-NCAM对多巴胺能神经细胞的保护作用。说明NCAM转位到脂筏上是其介导GDNF保护DA能神经元细胞的前提条件，脂筏在NCAM介导GDNF保护作用中起到关键作用。本项目探讨一种新的GDNF信号转导受体----NCAM是否参与了GDNF对DA能神经细胞的保护作用，以及NCAM向脂筏转位在其信号转导中的作用。这对于进一步阐明GDNF对DA能神经细胞的保护机制，以及PD的防止具有重要意义。