Duchenne型肌营养不良症(Duchenne Muscular Dystrophy,DMD)是一种X连锁隐性遗传病，以进行性四肢近端骨骼肌萎缩无力、小腿腓肠肌假性肥大为特征，是最常见的神经肌肉疾病。患者多于20岁左右死于呼吸衰竭和/或心力衰竭。其病因是由于X染色体的抗肌萎缩蛋白基因突变，导致其编码的基因产物抗肌萎缩蛋白(dystrophin，DYS)缺乏。 目前对DMD仍无有效的治疗办法，研究主要集中在药物治疗、基因治疗和细胞治疗。药物治疗只能作用于DMD病理生理的特定环节，暂时缓解但无法阻止病情进展。基因治疗是向靶细胞引入正常有功能的基因以纠正或补偿致病基因所产生的缺陷，从而达到治疗目的，但也存在表达效率低、分布局限、载体容量不足以携带全长DYS基因、具有生物毒性等缺陷而致应用困难。DMD细胞治疗包括成肌细胞和干细胞移植治疗，成肌细胞移植采用局部注射，治疗部位局限，不能治疗心肌与膈肌损害，且dystrophin表达时间短，这些问题阻碍了成肌细胞移植的临床应用；干细胞因携带人体正常的基因组，具有成肌分化潜能，是细胞移植治疗DMD较为理想的选择。 骨髓干细胞移植被认为是目前较有前途的治疗方法。研究认为骨髓中的造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)和间充质干细胞(mesenchymal stemcells，MSCs)都具有分化为肌细胞的潜能，其中MSCs由于取材方便、来源丰富、容易培养、分化能力强而日益成为干细胞研究的热点。MSCs具有多向分化潜能包括可以向肌细胞分化已经十分明确，但是其在体外、体内向肌细胞分化的效率都还不高，而其中关键性的因素是什么并不清楚，也一直是广大学者十分关心而未能解决的问题。对于DMD患者来讲，主要病理损害在骨骼肌组织，所以提高MSCs移植后向骨骼肌分化的效率及参与骨骼肌功能修复的能力是必须的。上述问题的解决对于MSCs移植治疗DMD具有重要的临床指导意义。 Myostatin(growth determining factor-8，GDF-8)是最近才鉴定的转化生长因子β(TGF-β)/发育生长因子超家族的一个新成员，它是一个结构高度保守，影响肌肉发育和生长的关键性负性调节因子，研究证明它的负性成肌调节作用主要是通过抑制肌前体细胞的增殖和分化，使这些细胞不能向骨骼肌转化，最终影响骨骼肌的发育和生长，而抑制myostatin的作用通路或基因突变所致myostatin的缺失，都可导致动物和人的骨骼肌异常增生和肥大。MSCs在体外诱导成肌的过程中是否有myostatin的表达?而抑制或阻断它表达后的作用通路能否提高MSCs向肌细胞转化的比例?而在用MSCs移植治疗mdx鼠时，如果用特异性抗体中和体内产生的myostatin后，能否使移植的MSCs更多向骨骼肌分化并表达多量的dystrophin蛋白?以及它们的机制是什么?这些正是本研究所关心和要解决的问题。 本研究拟将培养的MSCs首先在体外用5-氮胞苷进行成肌分化诱导，检测myostatin的表达，并用抗体中和产生的myostatin后，检测MSCs体外成肌分化的效率；然后在用MSCs移植治疗mdx鼠时，用抗体中和mdx鼠体内产生的内源性myostatin后，观察MSCs在骨骼肌融合的比例和新生dystrophin的表达，从而为MSCs移植和阻断myostatin的作用结合起来治疗DMD提供理论基础。 材料和方法: 1.实验材料 1.1试验动物 3-4周龄的SD雄性大鼠15只作为供体鼠，用于MSCs的分离和培养，进行体外实验和细胞移植。7-9周：mdx鼠36只，12只为未治疗组的阴性对照，12只为单纯MSCs移植的实验对照组，12只为myostmin抗体处理的实验组。分别于移植后1周、4周、16周取材，保持各组、各时间点动物为4只。 1.2实验试剂与器材(略) 2.实验方法 2.1 MSCs的分离培养和鉴定 应用DMEM培养SD大鼠骨髓干细胞，差速贴壁法分离、扩增及纯化MSCs，并进行表面抗原鉴定，将形态一致的P5代MSCs用于体外实验和移植。 2.2 体外诱导MSCs成肌分化时myostatin的免疫荧光、RT-PCR、Western Blot检测 将P5代MSCs按1×10<'5>/孔接种至6孔板，细胞生长至60-70﹪融合时，实验组按终浓度10 μmol/L加入5-氮胞苷诱导分化24小时后，改为含2﹪HS的DMEM诱导培养基继续培养3天、7天、14天，相应对照组不给与5-氮胞苷。于不同时间点做免疫荧光、RT-PCR和Western Blot，检测实验组和对照组细胞myostatin的表达。 2.3 抗myostatin抗体在体外对MSCs诱导成肌分化的影响 经5-氮胞苷诱导分化后的MSCs，其中实验组加入终浓度分别为2gg/ml、8gg/ml、16μg/ml的抗myostatin抗体，相应对照组不给与myostatin抗体，继续培养3天、7天、14天。取处理后3天的细胞用于MyoD、7天后的细胞用于myogenin、14天后的细胞用于MHC检测，分别做免疫荧光、RT-PCR、Westert Blot。 2.4 Mdx鼠移植前后的处理方案 在细胞移植前3天，对实验的mdx鼠进行γ射线照射(7.0y剂量)。实验组于移植前1天腹腔注射抗myostatin抗体(6mg/kg)，以后每周一次，对照组则给予等量0.01 M PBS。 2.5 MSCs的标记和移植 取生长良好的p5代细胞，于移植前48小时、以终浓度为10μmol/L的BrdU掺入培养细胞中，尾静脉注射入标记的MSCs，移植细胞数量为1.2X10<'7>/只。 2.6 MSCs移植后在mdx鼠体内各器官的致瘤、致畸型观察 BrdU标记的MSCs移植入mdx鼠后在相应时间点剖析各器官，观察其形态结构有无异常，有无肿瘤或者畸形的发生。 2.7 MSCs移植后16周肌酸激酶(CK)的测定 移植后分别取各组mdx鼠外周血1.2ml，取血清约250ul，用CK-NAC检测CK值。 2.8 移植后16周mdx鼠肌肉组织HE染色 分别取各组mdx鼠腓肠肌的冰冻切片进行常规HE染色，在镜下观察细胞形态，×400倍取8个视野，计数肌核中心移位纤维数目，并计算其比例。 2.9 移植后1周腓肠肌BrdU与Myod的免疫荧光双标检测 取移植后各组mdx鼠的腓肠肌进行冰冻切片做免疫荧光双标染色，检测Myod的表达情况及阳性核的来源。 2.10 移植后8周腓肠肌BrdU与myogenin的免疫荧光双标检测 取移植后各组mdx鼠的腓肠肌进行冰冻切片做免疫荧光双标染色，检测myogenin的表达情况及阳性核的来源。 2.11 移植后16周腓肠肌BrdU与MHC的免疫荧光双标检测 取移植后各组mdx鼠的腓肠肌进行冰冻切片做免疫荧光双标染色，检测MHC的表达情况及阳性纤维的来源。 2.12 移植后16周腓肠肌DYS的免疫荧光、RT-PCR、Western Blot检测 取移植后各组mdx鼠的腓肠肌进行免疫荧光双标染色、RT-PCR和Westemblot，检测dystrophin的表达情况及阳性纤维的来源。 2.13 统计学分析 所有统计学数据采用SPSS 10.0进行检验分析，有意义水平为P<0.05。 结论: 1.在体外实验中证实，。MSCs在用5.氮胞苷诱导成肌分化时，于不同阶段都可表达大量的myostatin，通过其分泌作用抑制了MSCs向成熟肌管的进一步分化。 2.应用myostatin单克隆抗体在有效中和MSCs诱导分化时产生的myostatin后，抑制其负性成肌调节作用，可明显促进MSCs在体外向肌细胞的分化。 3.在用MSCs尾静脉移植治疗mdx鼠时，应用myostatin单克隆抗体中和mdx鼠体内产生的内源性myostatin后，在增加骨骼肌体积的同时，可以提高MSCs移植后在体内向骨骼肌细胞分化的成功率，并表达dystrophin蛋白。 4.在用myostatin抗体处理mdx后，没有观察到除骨骼肌外的其它组织器官的异常改变，说明此方法是安全可行的。