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研究背景及目的非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种无过量饮酒史,以肝实质细胞脂肪变性和脂肪堆积为特征的一种临床病理综合征。当前我国NAFLD发病率不断升高,已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病。目前尚无疗效理想的NAFLD治疗药物,因此寻找有效的NAFLD防治药物成为当今面临的重要课题。护肝清脂片,来源于名老中医经验方,由泽泻、山楂、三七、蒲黄等中药组成,临床疗效显著。本课题前期研究表明,护肝清脂片能改善NAFLD大鼠肝脂肪变性,降低血脂和和炎症反应。进一步研究表明其可通过激活脂联素及其下游靶分子改善HepG2模型中的肝脂肪变性,增强细胞抗氧化能力。但中药复方有效成分繁多,单一的通路不足以解释其治疗疾病的相关机制,蛋白质组学的发展为研究中药治疗疾病的作用机制提供了可能。iTRAQ技术是由美国ABI公司开发的同重标签标记的相对和绝对定量(iTRAQ)技术,相对于传统定量方法,具有灵敏度高,重复性好,适用范围广等优点。本次实验采用iTRAQ定量蛋白质组学技术探讨护肝清脂片对NAFLD大鼠肝脏蛋白质表达的影响及防治NAFLD相关机制。方法将大鼠随机分为6组:模型组、正常组、非诺贝特组(0.1g/kg)、护肝清脂片低(0.54g/kg)、中(1.08g/kg)、高(2.16g/kg)剂量组。在高脂饲料造模的同时给予相应的药物持续给药12周。12周结束后,测定相关生化指标、肝指数、肝脏抗氧化应激能力、炎症因子水平,HE染色及油红O染色观察肝组织病变程度。采用iTRAQ结合SCX-non-LC-MS/MS技术探讨护肝清脂片对NAFLD大鼠肝脏蛋白质表达的影响及防治NAFLD的相关机制,并对筛选的差异表达蛋白进行 western blot 验证。结果1、护肝清脂片能显著降低NAFLD大鼠血清AST、ALT、TC、TG水平,升高 T-AOC、SOD、GSH-Px水平,降低 TNF-α,IL-6 及 IL-1β水平。HE 及油红O染色结果表明护肝清脂片能显著改善NAFLD大鼠肝组织脂肪变性。2、本次试验共鉴定到的蛋白数为3271个,定量结果中发现显著差异的蛋白数为 277(HFD:Con)、316(HH:Con)、210(HH:HFD)。Pathway 分析这些差异蛋白可能涉及 fatty acid metabolism、inflammatory response、oxidative stress、bile secretion、PPAR 等通路。3、从iTRAQ筛选出来的差异表达蛋白中,选择PHYH、ACSL1、hemopexin、ORM1、FABP4、Sult2a1及ASS1进行western blot验证,结果显示,与模型组相比,护肝清脂片高剂量组大鼠肝组织PHYH、ACSL1、Sult2a1、ASS1蛋白表达水平表达显著升高(P<0.01),ORM、hemopexin、FABP4表达水平显著降低(P<0.01),与iTRAQ定量结果一致。结论护肝清脂片能显著改善NAFLD大鼠肝脂肪变性,其作用机制可能与减少脂质及胆汁酸蓄积,减轻氧化应激及炎症反应,抑制内质网应激及内毒素对肝脏的损伤有关。PHYH、ACSL1、hemopexin,、ORM1、FABP4、Sult2a1 及 ASS1有望成为NAFLD的治疗靶点。