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布鲁氏菌病是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种人畜共患传染病,可引发病畜流产和睾丸炎,给畜牧业造成巨大的经济损失。目前许多国家对该病采取了相应的防控措施,如疫苗免疫、扑杀等,但收效甚微;弱毒疫苗免疫易感畜群,血清学检测通常呈阳性,不能与自然感染动物进行有效区分,不利于畜群的净化,同时某些疫苗仍具有一定的毒力,仍能引发孕畜的流产;布鲁氏菌019株是上世纪80年代在新疆本地分离的1株绵羊附睾种布鲁氏菌,以其为研究对象进行新型布鲁氏菌疫苗的研究具有重要的现实意义。目的:通过物理和化学的方法对布鲁氏菌019株进行诱导突变,分析生长状况及毒力的变化。同时针对布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶基因(pgm)定向构建布鲁氏菌019株pgm缺失株,并对其毒力及免疫效果进行评价;探讨布鲁氏菌019株致弱后作为疫苗株的潜力。方法:(1)布鲁氏菌019株分别采用吖啶橙(0.1g/L和0.05g/L)、苯酚(0.1g/L和0.05g/L)和紫外照射(5min和2min)处理,每组处理50次,测定各处理组细菌生长曲线及代时变化;腹腔注射小鼠测定脾脏指数和脾脏菌落形成单位(CFU);(2)分别以热灭活的布鲁氏菌019株和枯草芽孢杆菌基因组为模板,分别扩增pgm基因上下游同源臂及SacB基因,通过融合PCR技术将pgm基因上下游同源臂进行融合,将融合片段和SacB基因连接pGEM-7zf+载体,构建pGEM-7zf-?pgm-SacB自杀载体,电转化重组质粒pGEM-7zf-?pgm-SacB,通过氨苄、蔗糖两次筛选阳性菌落,并对阳性菌连续传代10次进行遗传稳定性检测;(3)腹腔注射布鲁氏菌019株、019?pgm、疫苗株S2、疫苗株M5-90,比较各菌株对小鼠脾脏指数及脾脏CFU的变化。同时制备布鲁氏菌019株及019?pgm缺失株的灭活全菌佐剂疫苗,皮下免疫小鼠后,每隔10天采血并分离血清,检测其IgG和IFN-γ的含量,评价其免疫效果。结果:(1)布鲁氏菌019株经不同浓度吖啶橙和苯酚诱导,以及不同时间紫外照射后,其自身生长趋势类似于亲本株019,但其进入稳定期的时间均早于亲本株;而且布鲁氏菌不同处理组其代时均长于未处理组,并随着浓度和时间的增加,代时也相应延长。将不同处理的布鲁氏菌腹腔注射小鼠后,其脾脏指数显著性高于PBS组(P<0.05),其中紫外照射及苯酚(0.1g/L)处理组类似于M5-90,且显著低于亲本株(P<0.05);各浓度的吖啶橙处理组均显著性高于疫苗株M5-90(P<0.05),与亲本株无明显差别。脾脏CFU结果显示,各处理组均高于M5-90疫苗株,其中紫外照射(5min)及苯酚(0.1g/L)处理组显著性低于019株(P<0.05);各处理组脾脏CFU均显著性高于布鲁氏菌M5-90(P<0.05),其他各处理组无明显差异。(2)成功扩增大小约为950bp和973bp的pgm基因上下游同源臂目的条带,通过融合PCR技术将其融合,并最终将融合片段与SacB基因连接至自杀载体pGEM-7zf+,电转化后,成功获得了布鲁氏菌019?pgm,且10代内未发生回复突变。(3)腹腔注射各布鲁氏菌菌株后,小鼠脾脏指数及脾脏CFU结果显示,布鲁氏菌019?pgm与其亲本株019无明显差异(P>0.05),而显著性高于布鲁氏菌M5-90和S2组(P<0.05);皮下注射灭活全菌佐剂制剂后,检测血清中IgG和IFN-γ的水平发现,30天内019?pgm灭活全菌佐剂制剂其IgG含量和INF-γ与亲本株019灭活的全菌佐剂制剂相比差异不显著(P>0.05),且均显著性低于疫苗株M5-90(P<0.05);但在第30天,019?pgm活全菌佐剂制剂诱导产生的IFN-γ含量最低,显著低于其他实验组。结论:布鲁氏菌019株经吖啶橙、苯酚以及紫外照射处理后,生长繁殖力被抑制,毒力降低,紫外照射(18w,波长253.7nm,5min)对布鲁氏菌019株的致弱效果较好。成功构建了布鲁氏菌019Δpgm基因缺失株,小鼠实验表明pgm基因缺失株与亲本株019相比毒力未有明显改变;制成灭活佐剂制剂,IgG和,IFN-γ的水平与亲本株相当,但显著性低于疫苗株M5-90。