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维生素A是一种天然的脂溶性维生素,作为人体必需的营养元素,它参与机体的多种生理过程。维生素A非常不稳定,市售维生素A多以维生素A酯类衍生物形式存在,其中主要包括维生素A醋酸酷和维生素A棕榈酸酯。相比而言,维生素A棕榈酸酯的结构更加稳定,不易被破坏,在化妆品、药物、饲料等行业已得到广泛应用。目前,维生素A棕榈酸酯的生产仍主要依赖于化学法,由于其存在诸多缺点,寻求一种绿色制造工艺成为亟待解决的问题。本课题为了实现维生素A棕榈酸酯工业化生产,提出一条新的合成路径,即化学-酶法合成维生素A棕榈酸酯。从脂肪酶的固定化方法、维生素A醋酸酯的碱液水解以及固定化脂肪酶在非水相体系中酯化合成维生素A棕榈酸酯三个方面进行研究。为了获得较纯的脂肪酶酶粉用于固定化研究,以实验室构建的基因工程菌Pichia pastorisX-33/CALB高密度发酵,对发酵罐中的生长产酶曲线进行了测定,其细胞湿重达到311.0 g/L,重组脂肪酶酶活达到8.0 U/mL。重组脂肪酶经过分离纯化,最终纯化倍数为1.8倍,收率为81.6%,其比酶活达到8.1 U/mg。本文采用物理吸附法将游离的CALB固定到非水溶性载体上,选择的载体为大孔吸附树脂。固定化的最佳参数为:固定化载体选择大孔吸附树脂AB-8,最适Na2HP04-柠檬酸缓冲液(Na2HP04和柠檬酸的摩尔浓度分别为0.05 M和0.025 M)pH为6.0,酶液浓度为16 g/L,在35℃,180 rmp条件下,预处理后的大孔吸附树脂AB-8与酶液按质量体积比1:20比例混合,水浴摇床中固定化2h,蛋白吸附率为87.5%,所得固定化脂肪酶的酯化比酶活为1034.4 U/g固定化酶,同时对固定化酶的酶学性质进行了研究。对维生素A醋酸酯在碱性条件下的水解反应进行了研究,由于维生素A醋酸酯较难溶于水,用碱液不能直接水解,在水解的过程中需要添加助溶剂,从而提高水解率。得出最佳的水解反应条件:在16℃,200 rpm条件下,10 g维生素A醋酸酯,8 mL无水乙醇,10 mL5MKOH溶液,水解1 h,维生素A醋酸酯的水解率可以达到100%。利用制备的固定化脂肪酶进行维生素A棕榈酸酯的生物催化合成,同时更进一步研究其酯化反应条件。研究发现在萃取过程中,一定量的乙醇溶于非水相体系中,固定化酶不仅催化维生素A棕榈酸酷的合成也能够催化棕榈酸乙酯的合成,导致后续产物的分离更加困难和复杂,同时在低底物摩尔比的条件下副产物棕榈酸乙酯的生成大大影响了维生素A棕榈酸酯的产率。为了避免棕榈酸乙酯形成,水洗除醇是一个关键步骤。其最佳酯化反应条件是:以正己烷为非水相体系,正己烷萃取液水洗6次,底物浓度350 g/L(以维生素A醋酸酯计),底物摩尔比1:1.1,固定化酶添加量30%(w/w维生素A醋酸酯),0.5 g无水硫酸镁,在30℃、180 rpm条件下,反应lh,维生素A棕榈酸酯的产率可以达到96%。实验采用简单有效的液液萃取方法,实现了对反应产物的分离和纯化,纯化后的维生素A棕榈酸酯的纯度达到99.0%,回收率为80.3%。