目的:探索体外分离培养和扩增兔骨髓间充质干细胞的方法。观察兔骨髓间充质干细胞移植到碱烧伤的兔角膜表面后,细胞的存活、迁移和分化情况,探讨间充质干细胞在体外向角膜上皮细胞横向分化的可能性,为眼科临床治疗角膜上皮细胞和角膜缘干细胞缺损或功能紊乱提供新思路。方法:18只新西兰兔(2.0～2.5kg)麻醉后,每只选左眼无菌条件下用1mol/L NaOH浸透的环型滤纸片与角膜密切接触1min建立角膜碱烧伤动物模型。人羊膜经胰蛋白酶-依地酸处理去除其表层细胞。抽取兔髂骨骨髓,置于等体积的兔单核细胞分离液(密度1.094g/ml)上,2500r/min离心25min,吸取含单个核细胞的乳白色液体层,加入含体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM培养液进行细胞培养,观察并绘制细胞生长曲线。用流式细胞术检测第三代细胞的CD29、CD45、CD34表达情况。将第三代细胞接种于铺有羊膜基质的培养皿中进行培养,移植术前48小时将5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)加入到培养基中(终浓度为10μmol/L)。将18只碱烧伤角膜缘干细胞缺损模型兔随机分为对照组、单纯羊膜基质移植组和兔骨髓间充质干细胞移植组,每组6只兔子6只眼。模型建立1个月后行移植手术,并对术后的角膜进行观察。术后4周,取各实验组动物角膜行石蜡切片,苏木精-伊红(HE)染色观察角膜组织结构的变化,并进行BrdU和细胞角蛋白AE5单克隆抗体免疫组化染色以观察兔骨髓间充质干细胞的存活以及向角膜上皮细胞方向分化的情况。结果:由兔单核细胞分离液获取的骨髓单个核细胞,呈圆形,24h大量贴壁,3d后进入快速增殖期,呈梭形并聚集成细胞集落,12d左右融合达80%～90%。流式细胞术检测结果显示,此次培养的第3代细胞高表达CD29,不表达CD34和CD45,符合骨髓间充质干细胞的特性。兔眼经环行滤纸片碱烧伤后,角膜出现混浊、新生血管化和瘢痕化。印迹细胞学检查提示角膜表层结膜化。兔骨髓间充质干细胞移植术后兔角膜基本保持透明,新生血管细小,角膜中央无新生血管;角膜病理学检查可见与正常角膜类似的结构特点,上皮细胞排列整齐,与基质层连接紧密,偶见炎症细胞,未见明显杯状细胞和新生血管;角膜免疫组化染色结果显示:BrdU阳性,AE5阳性。单纯羊膜基质移植术后兔角膜中度混浊,新生血管接近角膜中央;角膜病理学检查可见排列不规则的复层上皮细胞间夹杂少量杯状细胞,角膜基质层可见炎症细胞和少量新生血管;角膜免疫组化染色结果显示:BrdU阴性,AE5阴性。空白对照组兔角膜明显混浊,角膜中央部大量的新生血管;角膜病理学检查可见角膜表层细胞增多、排列不规则,并且可见大量杯状细胞侵入,角膜基质层胶原纤维排列疏松紊乱,有大量炎症细胞和新生血管浸润;角膜免疫组化染色结果显示:BrdU阴性,AE5阴性。结论:采用兔单核细胞分离液密度梯度离心和贴壁筛选相结合的方法可以获取纯度较高的兔骨髓间充质干细胞。通过碱溶液环形滤纸片烧伤的方法可以建立角膜缘干细胞缺损的动物模型。以羊膜基质为载体移植至兔角膜基质层上的兔骨髓间充质干细胞,可存活并增殖分化为角膜上皮细胞或角膜上皮细胞样细胞而发挥功能,在治疗角膜碱烧伤角膜缘干细胞缺损时,疗效明显优于单纯羊膜基质移植。骨髓间充质干细胞移植有望成为治疗角膜缘干细胞缺损的有效方法,值得进一步研究。