论文部分内容阅读
Janus激酶(Janus kinase,JAK)是一类非受体酪氨酸蛋白激酶,参与细胞因子的信号传递,可促进细胞增殖、分化、迁移和凋亡,与造血、免疫和形成脂肪等过程密切相关。但卵形鲳鲹JAK还未见报道。本研究应用RT-PCR和RACE技术,获得卵形鲳鲹JAK家族的TraJAK1、TraJAK2、TraJAK3和Tra TYK2的c DNA,应用生物信息学分析JAK家族基因的序列特征、蛋白结构、同源性及构建N-J树;应用q PCR检测健康鱼体中不同组织的表达模式,探讨在刺激条件下JAK家族基因在不同组织中的表达变化与LPS、poly I:C和溶藻弧菌引起反应的关联性;构建p ET-32a-TraJAK3原核重组载体,纯化到高纯度的融合蛋白。现将主要研究成果简述如下:1、TraJAK1、TraJAK2、TraJAK3和Tra TYK2的全长c DNA分别为4998bp、4332 bp、3933 bp和4179 bp;ORF分别为3531 bp、3402 bp、3336 bp和3510 bp,分别编码的氨基酸个数为1176、1133、1111和1169。蛋白结构域预测结果显示其4个蛋白均具有FERM结构域、SH2结构域和2个激酶结构域。同源性分析显示,上述4个蛋白与鱼类JAK家族蛋白的同源性最高,分别为73.8-93.3%、81.4-94.3%、65.0-94.1%和69.5-90.6%。N-J树分析显示,上述4个蛋白分别与鱼类的相应蛋白聚为一支,并与高体魳亲缘关系最近。表明TraJAKs与鱼类的亲缘关系最近,并在硬骨鱼进化过程中较为保守。2、检测健康卵形鲳鲹中上述4个基因的表达分布,结果表明,在各组织(脾脏、脑、鳃、头肾、心脏、肠、肝脏、皮肤和肌肉)中均有表达,但表达水平各不相同。TraJAK1、TraJAK2和Tra TYK2在肝脏表达量最高,TraJAK3在脾脏中表达量最高,且均在肌肉组织表达量最低,表明TraJAKs在鱼体的各种稳态过程中发挥作用。3、LPS刺激后,在头肾、脾脏、肝脏和鳃组织中TraJAK1、TraJAK2、TraJAK3和Tra TYK2基因m RNA的表达量均显著上调,而在肌肉组织中的表达量并无明显变化。在头肾、脾脏和肝脏组织中,TraJAK1在刺激后6 h和12 h的表达量显著上调,而在鳃组织中的表达量在刺激后6 h显著上调,其余时间点虽上升但不显著。在头肾和鳃组织中,TraJAK2在刺激6 h和12h的表达量显著上升,在脾脏和肝脏组织中,TraJAK2在刺激6 h、12 h和24 h的表达量显著上升,均在刺激后48 h下调至不显著。在头肾和脾脏组织中,TraJAK3在刺激后6 h和12 h的表达量显著上升,在肝组织中,TraJAK3在刺激后6 h、12 h和24 h的表达量显著上升,在鳃组织中,TraJAK3在刺激后12 h和24 h的表达量显著上升。在头肾组织中,Tra TYK2在刺激后6 h、12 h和24 h的表达量显著上调,在脾脏组织中,Tra TYK2在刺激后6 h、12h和48 h的表达量显著上调,在肝脏和鳃组织中,Tra TYK2在刺激后6 h和12 h的表达量显著上调,其余时间点表达量上升但不显著。poly I:C刺激后,TraJAK1在头肾、脾脏、肝脏和鳃组织中表达量均显著上调,分别在48 h、48 h、6 h和12 h达到峰值。TraJAK2在刺激第6 h和48 h的脾脏和鳃组织中的表达量显著上升,而在头肾和肝脏组织中,TraJAK2在刺激6h、24 h和48 h的表达量显著上调。TraJAK3 m RNA在头肾、脾脏和肝脏组织中在刺激后6 h的表达量显著上升,分别在48 h、24 h和48 h时间点达到表达量的峰值,TraJAK3在刺激24 h时间点的鳃组织中表达量显著上调,并在48 h达到峰值。Tra TYK2在刺激后6 h的头肾、脾脏、肝脏和鳃组织中的表达量显著上调,在刺激后12 h的脾脏、肝脏组织中表达量和在刺激后24 h的头肾组织表达量均显著上升,且均在刺激48 h后达到峰值。以上4个基因在肌肉组织中表达量均无显著变化。溶藻弧菌刺激后,在头肾组织中TraJAK1 m RNA在刺激后12 h的表达量显著上调,在脾脏组织中TraJAK1 m RNA在刺激后6 h和12 h的表达量显著上升,在肝脏组织中TraJAK1 m RNA在刺激后24 h和48 h的表达量显著上调,在鳃组织中TraJAK1 m RNA在刺激后48 h的表达量显著上升。TraJAK2 m RNA在刺激后6 h和12 h的头肾、脾脏和鳃组织中的表达量显著上调,在刺激后6 h的肝脏组织中的表达量显著上调。在头肾、脾脏和鳃组织中TraJAK3在刺激12 h和24 h后的表达量显著上升,在肝脏组织中TraJAK3在刺激24 h和48 h后的表达量上调。头肾、脾脏、肝脏和鳃组织中Tra TYK2在刺激后6 h和48 h时间点的表达量均显著上调。上述4个基因在刺激后的肌肉组织表达量并无显著变化。以上结果表明,TraJAKs基因可能参与机体抵御细菌、病毒入侵等相关免疫反应。4、将TraJAK3 ORF克隆至原核表达载体p ET-32a中,构建原核表达载体p ET-32a-TraJAK3,经IPTG诱导表达,重组蛋白以包涵体形式大量表达,并纯化得到高纯度的融合蛋白,为TraJAKs功能研究提供理论基础,也为了解TraJAK3蛋白结构和相互作用提供科学依据。