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第一部分Livin基因在不同人食管癌细胞株及食管上皮细胞株中的表达及意义 目的：检测Livin基因在食管上皮细胞株及不同食管癌细胞株中的表达情况，并筛选出高表达Livin的食管癌细胞株，为后续实验做准备。 方法：分别采用实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot从mRNA水平和蛋白水平检测 Eca-109、TE-1、 EC9706三种食管癌细胞株及食管上皮细胞株HEEC中Livin的表达情况。 结果：qRT-PCR及Western blot显示，在食管上皮细胞株HEEC中 Livin mRNA和蛋白的表达明显低于三种食管癌细胞株(P<0.05)；qRT-PCR显示，在上述三种食管癌细胞株中，Livin mRNA均有高表达。在 Eca-109细胞株中， Livin mRNA表达水平最高，且与 TE-1和EC9706细胞株中 Livin mRNA表达水平均存在着显著性差异(P<0.01)。TE-1与 EC9706之间 Livin mRNA表达水平无明显区别(P>0.05)；Western blot结果提示，Livin在上述三种食管癌细胞株中蛋白表达水平无明显差异(P>0.05)。 结论：在食管癌细胞株中 Livin的表达显著增高；Livin在Eca-109食管癌细胞株中的表达高于TE-1、 EC9706食管癌细胞株。通过筛选Eca-109细胞株可用于后续实验研究。 第二部分Livin和VEGF在食管癌组织中的表达与临床分期的相关性分析 目的：检测不同临床分期食管癌患者癌组织中，Livin与血管内皮生长因子（VEGF）的表达，探讨Livin和VEGF在食管癌组织中的表达与临床分期的相关性。 方法：使用蛋白质免疫印迹法、免疫组织化学法和RT-PCR检测癌组织Livin，使用蛋白质免疫印迹法和RT-PCR检测癌组织VEGF。 结果：随着食管癌的演进，食管癌组织中Livin和VEGF的表达逐渐增高，以临床Ⅳ期中的表达增高最为显著(P<0.01)，VEGF与 Livin表达具有显著相关性。 结论：Livin和VEGF参与了食管癌的演进，可能成为治疗食管癌的有效靶点之一。 第三部分靶向Livin的RNA干扰对食管癌凋亡相关蛋白Caspase-3和Caspase-9表达的影响 目的：探讨靶向 Livin的 RNA干扰对食管癌凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9的影响。 方法：采用慢病毒载体转染 Livin高表达的食管癌 Eca-109细胞株，从而有效地进行靶向Livin的RNA干扰。将Eca-109细胞分为正常对照组、阴性对照组和转染组。分别采用实时荧光定量 PCR和Western blot检测各组细胞中Livin、Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白表达情况。 结果：经过靶向Livin的RNA干扰后，实验组细胞中Livin基因mRNA表达水平较空白对照组和阴性组明显降低，且差异均具有显著性(P<0.01)；而与促进细胞凋亡相关的 Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达水平较均较空白对照组和阴性组明显升高，差异均具有统计学意义(P<0.01)；Western blot结果也提示，经过靶向Livin RNA干扰后，实验组细胞中 Livin基因蛋白表达水平较空白对照组和阴性组明显降低，且差异均具有显著性(P<0.01)；而与促进细胞凋亡相关的Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达水平较均较空白对照组和阴性组明显升高，差异均具有统计学意义(P<0.01)。 结论：针对Livin的RNA干扰可有效降低Livin高表达的食管癌Eca-109细胞株中Livin mRNA和蛋白水平。同时，与细胞凋亡相关的信号分子Caspase-3和Caspase-9 mRNA和蛋白水平均明显升高。该研究提示，针对 Livin的 RNA干扰可有效升高 Caspase-3和 Caspase-9的表达，从而促进食管癌细胞的凋亡。 第四部分RNA干扰Livin联合顺铂对食管癌细胞Eca-109增殖和凋亡的影响 目的:探讨RNA干扰Livin联合顺铂对食管癌细胞增殖和凋亡的影响及相关作用机制。 方法：首先构建病毒载体，采用慢病毒载体转染Livin高表达的食管癌 Eca-109细胞株，并联合顺铂进行干预。转染后，用分光光度法检测Caspase-3、Caspase-9在405 nm外时吸光度值；XTT检测转染后细胞增殖情况；采用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡；TUNEL检测细胞凋亡形态改变；电镜下观察凋亡细胞超微结构改变。 结果：转染后，分光光度法提示 Eca-109细胞株中 Caspase-3、Caspase-9表达明显增强(P<0.01)；XTT结果显示，Eca-109细胞株存活率明显降低(P<0.01)；RNA干扰联合顺铂干预的 Eca-109较单纯顺铂干预的细胞明显减少(P<0.01)；细胞周期和凋亡检测发现，经 RNA干扰后，细胞周期主要被阻滞于S期；而相于单纯顺铂干预，RNA干扰联合顺铂可明显增加阻滞于S期的细胞数目；经RNA干扰后，细胞凋亡率明显增加；而相于单纯顺铂干预，RNA干扰联合顺铂可明显增加细胞凋亡率。电镜下可见典型的凋亡细胞特征。 结论：Livin靶向RNA干扰联合顺铂通过上调Caspase-3、Caspase-9的表达从而抑制 Eca-109细胞的增殖和促进其凋亡。