论文部分内容阅读
醋酸CoA转移酶(AarC)属于第I类CoA转移酶家族,催化CoA从acyl-CoA转移到琥珀酸上。在醋酸菌变异的柠檬酸循环中,AarC起到的关键作用,研究AarC的催化机制对于醋酸菌变异的柠檬酸循环有非常重要的意义。关于醋酸CoA转移酶的催化机制的研究由来已久,多年来也备受科学工作者们的关注。早在1967年,Jenck等人就提出第I类CoA转移酶的催化机制为乒乓机制,它由两个半反应组成,反应中会形成酶-CoA中间体。几年之后,他们基于分子交换色谱和动力学实验的方法提出在两个半反应中会形成酸酐中间体。有趣的是,第I类CoA转移酶的催化反应在发生羧酸盐的交换之后,第二个半反应就是第一个半反应的逆反应。至今,关于AarC的研究也有很多,但关于AarC的催化机制的系统理论研究尚未见报道。多年来,理论化学的蓬勃发展推进了生物化学领域的研究进程,尤其是QM/MM方法的提出和发展更是为我们从理论上研究酶催化机制提供方便。为了能够在原子水平上详细阐述AarC酶的催化机制,我们采用QM/MM与MD联合的方法研究AarC的催化机制。研究结果表明,AarC的第一个半反应是由两步亲核进攻过程构成。第一步是Glu294上的OE1原子亲核进攻acyl-CoA上的C1原子,测量Mulliken电荷以及原子间距离的结果表明,C1-S1P键断裂与OE1-C1键的形成同时发生,之后产生酸酐中间体。第二步是CoA上的硫离子对acyl-Glu294上的CD原子进行亲核进攻,OE1-CD键断裂的同时形成CD-S1P键,生成产物glutamyl-CoA thioester。AarC催化反应的第一步为决速步,能垒为14.89kcal/mol。此外,突变体N347A与AarC的反应路径一致,却使能垒升高到18.50kcal/mol。也就是说,突变并没有改变反应路径,我们的研究结果与实验相符合,即突变导致能垒升高,反应难度增加,但是没有使AarC丧失催化活性。在此基础之上,我们还明确了非催化残基Asn347对于酶结构以及在酶催化反应过程中的特殊作用。一方面,Asn347能够帮助酶稳定过渡态和中间体的结构,并且通过氢键网络稳定活性位点;另一方面,Asn347通过锚定催化残基Glu294的侧链,使其处于一种利于反应发生的构象。在AarC的催化反应过程中,我们还明确了多个对过渡态和中间体稳定起到重要作用的非催化残基,分别为Asn347、Gln267、Ser268、Val270、Ser315、Gly388和Ser346。该项工作对于研究第I类CoA转移酶家族的催化机制提供了理论基础,尤其是对醋酸菌变异的柠檬酸循环具有重要的意义。